披針葉黃華\\(Thermopsis lanceolata\\)屬豆科\\(Leguminosae\\)黃華屬多年生草本植物,廣泛分布于內蒙古、甘肅、寧夏、青海等省區。多生于灘地、戈壁、石質山坡、流動沙丘等干旱荒漠環境下,其適應范圍極廣,抗寒性強,在堿化、鹽漬化土壤中能生長良好,是防風固沙的優良植物。除了重要的生態價值外,披針葉黃華還具有抗癌、抗心律失調、抗微生物、抗 潰 瘍 和 升 高 白 細 胞 等 多 方 面 的 藥 理 作用,對 植 物 病 蟲 害 的 防 治 也 顯 示 出 明 顯 的 效果,具有重要的藥用價值及開發成新型環保農藥的潛力。多年來,許多學者就其藥理、臨床和化學成分,特別是生物堿及其活性、種子萌發和幼苗生長等方面開展了大量研究,但迄今尚未見從生理生化角度揭示披針葉黃華適應鹽環境的相關報道。河西走廊是典型的干旱半干旱區和鹽堿區,鹽堿地面積大\\(1.798×106hm2\\),其鹽漬土鹽分組成以硫酸鹽為主,其次是氯化物-硫酸鹽,碳酸 鹽較少。本試驗以披針葉黃華試管苗為材料,研究不同鹽度梯度的NaCl和Na2SO4脅迫下試管苗的生長、脯氨酸、可溶性糖、可溶 性 蛋 白 含 量 和Na+、K+、Ca2+變化規律,比較披針葉黃華對不同鹽脅迫的響應差異,從離子平衡和有機溶質的積累等方面初步探討披針葉黃華適應鹽脅迫的滲透調節機制,為進一步高效開發利用披針葉黃華以及在鹽堿地的人工栽培提供參考依據。

1 材料和方法

1.1 材料的培養

將初代培養的披針葉黃華試管苗按單節莖段轉移到MS+2.0mg/L KT+0.5mg/L IAA+3%蔗糖+0.9%卡拉膠的培養基中進行培養。培養條件為:pH 5.5~6.0,培養溫度\\(25±2\\)℃,光照度3 000lx,每天光照14h。

1.2 材料處理

實驗選用NaCl和Na2SO4兩種中性鹽,將繼代培養的披針葉黃華試管苗切割成雙節莖段轉移到0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%和1.0% NaCl和Na2SO4的脅迫培養基中進行培養,以不加鹽的培養基為對照。每個處理40株,培養方法同上,脅迫培養30d后,取各處理試管苗用于生長指標、滲透調節物質含量和陽離子含量測定。

1.3 生理指標測定

脯氨酸含量的測定采用茚三酮顯色法;可溶性糖含量采用蒽酮比色法;可溶性蛋白質含量的檢測采用考馬斯亮藍G-250染色法;Na+、K+、Ca2+含量測定采用STOREY的方法,略有改動,按標準溶液配制方法配成待測金屬含量為1.000mg/mL的儲備液,測定時稀釋至所需濃度,制成標準曲線,求出回歸方程。取各脅迫濃度處理的試管苗20株,將根和葉分開,烘干至恒重,分別取0.1g材料用硝酸∶高氯酸\\(4∶1\\)進行消化處理后,用火焰原子吸收分光光度計測定Na+、K+、Ca2+含量,以去離子水做空白對照。

1.4 數據統計

所有測定均做3次重復,使用Excel 2003和SPSS 19.0進行數據處理和分析,Origin 8.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 不同鹽脅迫對披針葉黃華試管苗生長的影響
觀察發現,隨鹽脅迫濃度升高,披針葉黃華試管苗葉片變小變黃,新葉長出的時間逐漸延長,生長明顯被抑制;在1.0% NaCl脅迫下,試管苗葉片發黃或部分老葉首先萎蔫干枯脫落,但剛萌發出的新葉較少表現出鹽害癥狀,而相同濃度的Na2SO4脅迫下并未出現葉片干枯脫落現象\\(圖1\\)。經測定\\(圖2\\),披針葉黃華試管苗平均株高隨著兩種鹽脅迫濃度的增加而逐漸降低,且Na2SO4脅迫下降低的幅度較小。當鹽濃度增為1.0%時,NaCl脅迫組試管苗平均株高僅為對照的19.90%,而Na2SO4脅迫組試管 苗 平 均 株 高 仍 為 對 照 的33.47%。這 表 明NaCl脅迫對披針葉黃華試管苗生長的抑制作用大于Na2SO4,且此效應具有濃度依賴性?！緢D略】

2.2 NaCl和Na2SO4脅迫對披針葉黃華試管苗葉片有機滲透調節物質含量的影響
如圖3,A所示,披針葉黃華試管苗葉片中脯氨酸含量隨鹽濃度的增加而逐漸增加。其中,0.2%NaCl和0.2%、0.4% Na2SO4脅迫下,試管苗葉片脯氨酸含量與對照沒有顯著差異\\(P>0.05\\);而隨著鹽濃度繼續升高,兩種鹽脅迫試管苗葉片脯氨酸含量迅速升高,0.4%~1.0%的NaCl脅迫下分別為對照的6.89、8.99、16.69和13.59倍,0.6%~1.0% Na2SO4脅迫下分別為對照的6.75、11.03和12.66倍,且差異均達到極顯著水平\\(P<0.01\\)。同時,不同濃度鹽脅迫下披針葉黃華試管苗可溶性糖含量均比對照顯著增加\\(P<0.05\\),并隨脅迫濃度表現出持續升高的趨勢\\(圖3,B\\)。其中,在0.2%~1.0%的Na2SO4脅迫下,試管苗葉片可溶性糖含量分別為對照1.77、2.36、3.06、3.77和4.10倍;相同濃度的NaCl脅迫下,試管苗葉片可溶性糖含量分別為對照的1.71、1.96、2.14、2.78和3.46倍 。比較而言,Na2SO4脅迫下試管苗葉片中可溶性糖含量的增幅大于相同濃度NaCl脅迫處理?！緢D略】

另外,披針葉黃華試管苗葉片的可溶性蛋白質含量隨著NaCl濃度增加表現出先升高后降低的趨勢,而Na2SO4脅迫下則表現出持續升高的趨勢\\(圖3,C\\)。其中,與對照相比,試管苗葉片可溶性蛋白質含量在0.2%和0.4% Na2SO4脅迫下沒有顯著差異\\(P>0.05\\),在0.6%、0.8%和1.0% Na2SO4脅迫下分別顯著增加38.75%、48.40%和66.72%;當NaCl濃度為0.6%時,試管苗可溶性蛋白含量最高,比對照顯著增加34.83%,而當NaCl濃度增加為1.0%時,可溶性蛋白含量比對照降低2.8%,但未達到顯著水平。以上結果說明可溶性糖和可溶性蛋白含量增加有利于試管苗的滲透調節,且總體表現出對Na2SO4脅迫的調節能力強于同濃度NaCl脅迫。

2.3 NaCl和Na2SO4脅迫對披針葉黃華試管苗葉片離子含量及比值的影響
2.3.1 Na+、K+和Ca2+含量 披針葉黃華試管苗葉片與根系中Na+的含量隨NaCl和Na2SO4脅迫濃度的 增 加 逐 漸 上 升 且 均 顯 著 高 于 對 照 \\(P<0.05\\),但葉片中Na+含量明顯高于根系,兩器官間的差異卻隨鹽脅迫濃度的增加逐漸縮小\\(圖4,A\\)。其中,葉 片Na+含 量 的 增 幅 在0.2%時 最 大,在0.4%~1.0%間隨鹽濃度增加逐漸變緩;根系Na+含量在低鹽濃度下\\(≤0.4%\\)增加比較平緩,但在0.6%~1.0%間卻隨鹽濃度的增加而顯著上升。比較兩種鹽脅迫下試管苗葉片和根系Na+含量的變化發現,NaCl脅迫試管苗葉片Na+含量均比相同濃度Na2SO4脅迫處理高,而其根系Na+含量均比相同濃度Na2SO4脅迫處理低。

由圖4,B可知,隨NaCl和Na2SO4脅迫濃度的增 加,披針葉黃華試管苗葉片中K+含量逐漸降低,并顯著低于對照\\(P<0.05\\),且Na2SO4處理始終高于同濃度的NaCl處理;當鹽濃度為1.0%時,NaCl和Na2SO4脅迫葉片中K+含量分別比對照顯著降低59.6%和44.7%。同時,NaCl和Na2SO4脅迫試管苗根系中K+含量隨鹽濃度增加呈先下降后上升的趨勢,且NaCl處理始終略高于Na2SO4處理;當鹽濃度大于0.6%時,根系K+含量顯著高于對照\\(P<0.05\\),而鹽濃度為1.0%時,根系中K+含量達到最大,NaCl和Na2SO4處理較對照分別顯著增加了62.5%和56.3%。相同濃度的兩種鹽脅迫下,試管苗葉片中K+含量明顯高于根系,Na2SO4脅迫下試管苗葉片中K+含量明顯高于NaCl脅迫組\\(P<0.05\\),而其根系中K+含量與NaCl脅迫組差異不顯著\\(P>0.05\\)?！緢D略】

另外,NaCl和Na2SO4脅迫下披針葉黃華試管苗葉片和根系中Ca2+含量的變化趨勢相似,即隨著鹽濃度的增加逐漸降低\\(圖4,C\\)。其中,隨鹽濃度增加,披針葉黃華試管苗葉片Ca2+的含量呈現持續降低的趨勢且顯著低于對照 \\(P<0.05\\);而根系Ca2+的含量在鹽脅迫濃度為0.4%及以下時變化不顯著,在鹽脅迫濃度為0.6%及以上時顯著比對照下降\\(P<0.05\\)。比較NaCl和Na2SO4脅迫下試管苗葉片和根系Ca2+含量發現,Na2SO4脅迫試管苗葉片和根系Ca2+含量均高于相同濃度NaCl脅迫處理,葉片含量明顯高于同濃度下根系含量?？梢?披針葉黃華試管苗葉片和根系的離子含量及其對鹽脅迫的響應不盡相同。

2.3.2 Na+/K+和Na+/Ca2+比值 由表1可知,隨著鹽脅迫濃度的增加,披針葉黃華試管苗葉片與根系中Na+/K+和Na+/Ca2+均呈逐漸升高趨勢,且均顯著高于對照\\(P<0.05\\)。Na+/K+和Na+/Ca2+比值的提高既與試管苗葉片和根系中Na+含量的凈增加有關,也與葉片和根系中K+和Ca2+含量的降低有關。

NaCl脅迫下披針葉黃華試管苗葉片Na+/K+和Na+/Ca2+明 顯 高 于 相 同 濃 度Na2SO4脅迫組,而根系Na+/K+和Na+/Ca2+則低于Na2SO4脅迫組。以上結果說明Na2SO4脅迫對試管苗離子平衡的破壞作用明顯弱于NaCl脅迫,即披針葉黃華試管苗對Na2SO4脅迫的適應性明顯強于NaCl脅迫。

3 討論

3.1 NaCl和Na2SO4脅迫與試管苗有機滲透調節物質含量的關系

大多數研究者認為,脯氨酸的積累可作為一種耐鹽生理指標,但也有研究認為脯氨酸的積累與耐鹽性呈負相關,是脅迫對植物傷害的結果,其積累可反映滲透脅迫對植物傷害的程度。本研究中,低濃度鹽脅迫下試管苗葉片脯氨酸含量變化不明顯\\(P>0.05\\),隨鹽脅迫濃度的升高其含量顯著升高\\(P<0.01\\),結合中濃度鹽脅迫嚴重抑制了試管苗生長的事實,可推斷脯氨酸的積累是一種傷害反應,可反映鹽脅迫對試管苗的傷害程度。同時,由于NaCl脅迫下試管苗葉片脯氨酸增幅大于相同濃度Na2SO4脅迫處理,說明NaCl對披針葉黃華試管苗的傷害程度比Na2SO4大,這與不同濃度鹽脅迫下沼 澤 小 葉 樺 \\(Betula microphylla\\)和 鳳 毛 菊\\(Saussurea runcinata\\)幼苗脯氨酸含量變化結果一致。而1.0% NaCl脅迫處理葉片中游離脯氨酸含量略低于0.8% NaCl脅迫處理,可能與高鹽脅迫下試管苗植株枯萎,造成細胞死亡、使線粒體的膜透性失控,游離脯氨酸進入線粒體被相關酶類分解有關。

研究表明,鹽脅迫誘導植物細胞內可溶性糖含量增加,以降低細胞的滲透勢,提高植物組織的持水力,可溶性蛋白含量升高也有利于提高植物對鹽環境的耐受性。本試驗中,隨鹽脅迫濃度的升高,試 管 苗 葉 片 中 可 溶 性 糖 含 量 持 續 升 高,且Na2SO4脅迫下的增幅明顯大于相同濃度NaCl脅迫 下 的 增 幅;而 同 期 可 溶 性 蛋 白 含 量 增 幅 在Na2SO4濃度為0.4%及以下時并不顯著,這可能與本試驗材料的原生境———河西走廊的鹽漬土中鹽分以硫酸鹽為主有關,當Na2SO4濃度為0.6%及以上時,可溶性蛋白含量顯著高于對照,可能是高濃度Na2SO4脅迫誘導細胞中合成了鹽適應性蛋白,對其進行滲透調節,維持了細胞的正常代謝活性。

可見,在Na2SO4濃度低于0.6%時,可溶性糖是披針葉黃華試管苗主要的滲透調節物質,而在濃度為0.6%及以上時,可溶性糖和可溶性蛋白共同作用,調節試 管 苗 的 滲 透 勢。在NaCl脅 迫 濃 度 低 于0.8%時,試管苗受到可溶性糖和可溶性蛋白的共同滲透調節,而當NaCl濃度高于0.8%時,鹽脅迫抑制了可溶性蛋白的合成,可溶性糖成為主要的滲透調節物質。

Na2SO4脅迫下可溶性糖和可溶性蛋白的調節能力和適應鹽脅迫的調節范圍均大于NaCl,而作為本試驗中傷害指標的脯氨酸的積累卻小于同濃度NaCl脅迫的值。

3.2 NaCl和Na2SO4脅迫與披針葉黃華試管苗離子含量的關系

鹽脅迫促進Na+等有害離子大量進入植株體內,并造成積累,破壞植物體內的離子和水分平衡,對植株生長造成傷害。研究認為,K+在植物抗鹽中起作用,Na+誘導組織內K+含量降低是造成鹽害的原因之一。本研究中,鹽脅迫使試管苗葉片和根系的Na+、K+和Ca2+含量發生了深刻變化。

Na+含量在葉片和根系中均隨鹽濃度增加而上升,但根系Na+增幅明顯大于葉片,說明披針葉黃華利用積累在根系的Na+來維持細胞的滲透勢,滿足水分代謝的需要,從而減輕鹽脅迫對試管苗的傷害。

比較而言,Na2SO4脅迫下試管苗葉片中Na+增幅低于同濃度NaCl脅迫下的增幅,而根系中貯存的Na+卻高于同濃度NaCl脅迫下的量,這可能與Cl-毒害和SO42-保護有關。

兩種鹽脅迫下的K+含量在葉片中均下降,但仍維持在較高水平,這有利于正在生長的幼嫩組織中保持較高K+含量,避免營養虧缺使之耐鹽。同時,NaCl脅迫下葉片K+含量降幅大于相同濃度Na2SO4脅迫下的降幅,而根系K+含量維持較高水平,尤其在高鹽\\(≥0.6%\\)脅迫下增幅明顯。試管苗根系通過維持高K+含量,進而保證Na+/K+比仍維持在較低水平,由于Na+和K+間的拮抗作用,根系 高K+含量抑制了Na+過多進入,使運到葉片的Na+大為減少,維持了地上部離子平衡,緩解了鹽脅迫對試管苗的傷害,這與陳貴林等對白刺試管苗的研究結果相似,這可能是試管苗在高鹽環境下存活的原因之一。

Ca2+有助于提高植物對K+選擇性吸收的能力以及維持K+/Na+。本實驗低鹽\\(≤0.4%\\)脅迫下,試管苗葉片Ca2+含量隨鹽濃度增加迅速降低,而根系Ca2+含量變化不大 \\(P>0.05\\);高鹽 \\(≥0.6%\\)脅 迫 下 根 系Ca2+含 量 迅 速 降 低,抑 制 了Ca2+向葉片的運輸,導致葉片Ca2+含量進一步下降。由此可見,低濃度鹽脅迫下試管苗根系維持了較高的Ca2+濃度及低的Na+/Ca2+比,使離子平衡得以維持;高濃度鹽脅迫下,這種平衡被打破,導致大量有 害 離 子 進 入 植 物 體 內,造 成 鹽 害。同 時,NaCl脅迫下葉片Na+/K+和Na+/Ca2+增幅均大于相同濃度Na2SO4脅迫下的增幅,表明NaCl脅迫下試管苗的Na+、K+和Ca2+運輸選擇機制受到破壞程度較大,導致更多的Na+運輸到葉片,使光合細胞的膜結構和其它代謝過程受到傷害比Na2SO4脅迫下大,這可能是披針葉黃華試管苗在Na2SO4脅迫下 生 長 狀 態 好 于 同 濃 度NaCl脅 迫 的 原 因之一。

綜上所述,披針葉黃華試管苗在受到鹽脅迫時通過增加有機滲透調節物質,如可溶性糖和可溶性蛋白量來降低細胞的滲透勢,以及維持根系中較高的K+、Ca2+含量、抑制葉片中Na+的積累,調節Na+/K+和Na+/Ca2+處于較低水平,以此來適應鹽漬生境。Na2SO4脅迫下試管苗葉片Na+含量和Na+/K+和Na+/Ca2+比低于同濃度NaCl脅迫,而可溶性糖和可溶性蛋白的含量以及根系K+、Ca2+含量卻大于同濃度NaCl脅迫,從而使披針葉黃華對Na2SO4脅迫具有更強的適應性。

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