睡眠和覺醒過程不僅僅是某個神經核團的單獨活動,而且是全腦眾多神經核團的集體活動\\(網絡活動\\)過程.研究[1 -2]結果表明,下丘腦腹外側視前區\\(ventrolateral preoptic nucleus,VLPO\\)與結節乳頭體核\\(tuberomammillary nucleus,TMN\\)分別是促睡眠中樞和促覺醒調節中樞之一.80% 的 VLPO 神經細胞為 γ-氨基丁酸\\(GABA\\)能神經細胞和甘丙肽能神經細胞,而 TMN 是腦中組胺能神經細胞胞體集中聚集的區域,這兩個核團之間是否存在直接的雙向纖維投射以及其遞質釋放對睡眠 - 覺醒節律的形成與維持起何作用是目前研究的熱點.為了進一步證實 VLPO 和 TMN 核團是否存在雙向纖維投射,該研究通過腦立體定位技術,在大鼠的 VLPO 和 TMN 腦區分別微量注射熒光探針 Fast DiO[3]\\(一種可被纖維末梢吞噬,通過軸漿運輸達到胞體的熒光探針\\),觀察 TMN 和 VLPO 腦區神經細胞是否表達熒光.

1 材料與方法

1. 1 材料

1. 1. 1 實驗動物 清潔級成年 SD 大鼠 32 只,雌雄不拘,體重 250 ~300 g,安徽醫科大學實驗動物中心提供.所有動物隨機分組,對照組\\(12 只\\)\\(ACSF組,VLPO 與 TMN 均微量注射 ACSF\\),實驗組\\(各10只\\):① TMN + ACSF&VLPO + DiO 組\\(TMN 內微量注射 ACSF 以及 VLPO 內微量注射 Fast DiO\\);②TMN + DiO&VLPO + ACSF 組\\( TMN 內微量注射 FastDiO 以及 VLPO 內微量注射 ACSF\\) .大鼠均置于室溫 22 ~24 ℃,濕度維持 55% 以及 12 h 明/暗\\(光照08 ∶ 00 - 20 ∶ 00\\) 的通風環境中單獨飼養,自由飲水與攝食,活動不受限制.

1. 1. 2 藥品與劑量 細胞膜熒光探針 Fast DiO\\( Ex= 644 nm,Em = 663 nm,分子量:881. 72 \\( 美國 LLC公司\\);戊巴比妥鈉\\(中國醫藥集團上?；瘜W試劑采購供應站分裝廠進口分裝提供\\),使用前用 ACSF 配置;ACSF 成分\\(mmol/L\\):124 NaCl,4. 5 KCl,1. 6NaH2PO4,2. 1 MgCl2,2. 7 CaCl2,26 NaHCO3,10Glucose\\(pH = 7. 4\\).

1. 1. 3 主要儀器 腦立體定位儀\\( 深圳瑞沃德公司\\);ZH-GSZ 高速顱骨鉆\\(淮北正華公司\\);MODEL828 pH 計 \\( 美 國 Orion 公司\\); 微量注射器 \\( 瑞士Hamilton 公司\\); Leica 冰凍切片機 \\( 德國 Leica 公司\\);熒光顯微鏡\\(日本 Nikon 公司\\).

1. 2 方法

1. 2. 1 動物手術 大鼠經戊巴比妥鈉\\(50 mg /kg\\)腹腔注射麻醉后,將其頭部固定于腦立體定位儀上,常規頭部備皮,無菌手術操作暴露顱骨并用 0. 3%H2O2燒灼清潔顱骨表面,將兩個不銹鋼引導管\\(22-gauge\\)按照 Paxinos 和 Waston 大鼠腦立體定位圖譜[4]分別插入 VLPO\\(AP: -0. 36 mm;R:1. 30 mm;H:- 7. 00 mm\\) 和 TMN\\(AP: - 3. 96 mm;R:1. 50mm;H:- 7. 70 mm\\),引導管底端距目的核團 2 mm,供 VLPO 和 TMN 內微量注射熒光探針使用.注射完畢后,逐層縫合,送回動物室,自由飲水進食.術后將大鼠置于記錄室中休息,待麻醉蘇醒后觀察動物行為活動.

1. 2. 2 藥物注射 使用 Hamilton 微量注射器\\( 針尖直徑 26-gauge\\)通過引導管向目的核團注射 ACSF\\(對照組\\)或含熒光探針 ACSF\\(實驗組\\)3μl,注射速度為 1 μl/min,注射完畢滯針 3 min 防止藥液溢出.

1. 3 組織學鑒定 大鼠術后 72 h 后,行戊巴比妥鈉\\(50 mg/kg\\)腹腔注射麻醉并仰臥位固定于手術臺上,暴露心臟,從心尖處進行灌注,首先注入 0. 01mmol / L PBS 液,待肝臟顏色變淡,心耳處流出液清亮后更換為 4% 多聚甲醛,先快后慢繼續灌注\\(PBS液用量約200 ml,多聚甲醛用量約250 ml\\).灌注結束后完整取下腦組織并 4% 多聚甲醛固定 24 h,次日使用 30%蔗糖 PB 溶液脫水至沉底.取各組大鼠的大腦的 TMN 和 VLPO 進行冰凍切片,片厚20 ~25μm,光學顯微鏡下觀察引導管位置以及藥物注射位點,僅對定位準確的大鼠進行實驗數據的統計.共計 8 只大鼠因定位不準確予以剔除實驗,其中對照組 4 只,實驗組各 2 只.熒光顯微下觀察 Fast DiO標記的熒光效果并拍照.

2 結果

2. 1 神經損傷嚴重程度 \\( neurological severity-score,NSS\\)評分 采用雙盲法,在標志物注入腦室后 2 h 和 24 h 對各組大鼠進行 NSS 評分.麻醉良好的動物在注射過程中沒有發生抽搐、呼吸紊亂等異常情況.術后 24 h 所有大鼠評分已基本正常.

2. 2 熒光顯微鏡觀察熒光標記效果2. 2. 1 TMN + ACSF&VLPO + DiO 組 TMN +ACSF&VLPO + DiO 組在 VLPO 核團內注射熒光探針 Fast DiO 后 72 h,TMN 腦區可見明顯的綠色熒光,熒光均勻存在于細胞質中,核未清晰顯示,見圖1.神經細胞的熒光強度相對強,成像清晰,對比度高,容易辨別.TMN 之外的區域鮮見綠色熒光標記,綠色熒光可持續到藥物注射后 120 h.而 VLPO核團內注射 ASCF,TMN 腦區未見熒光\\(結果未顯示\\).

2. 2. 2 TMN + DiO&VLPO + ACSF 組 TMN +DiO&VLPO + ACSF 組在 TMN 核團內注射熒光探針Fast DiO 后 72 h,VLPO 腦區可見明顯的綠色熒光,熒光均勻存在于細胞質中,核未清晰顯示,神經細胞的熒光對比度高,容易辨認,但成像的密度較低,見圖 2.而 TMN 核團內注射生理鹽水,VLPO 腦區未見熒光\\(結果未顯示\\).

3 討論

Saper et al[5]曾提出促睡眠神經細胞與促覺醒神經細胞相互抑制的假說,即 flip-flop 模型,其控制著睡眠覺醒之間的時相轉換.VLPO 80% 的神經細胞是 GABA 能和甘丙肽能神經細胞,且向腦中與覺醒相關的眾多區域發出纖維投射,調節睡眠 - 覺醒時相間的相互轉換[6].下丘腦后部的 TMN 及其鄰近區域含有組胺能神經細胞,是該神經細胞在中樞神經系統中聚集的唯一部位,其神經纖維以兩條上行和一條下行通路廣泛投射至全腦,其中以下丘腦核團,內側隔核以及斜角帶密度最高[7 -8].TMN 神經纖維直接向皮質進行投射的同時又間接地通過丘腦 - 皮質系統和基底前腦的膽堿能神經細胞共同激活皮質,維持覺醒,并同時接受 GABA 能抑制性纖維投射[7,9].

軸漿運輸是神經細胞的特性之一.神經細胞不斷地從胞體中將各種成分運輸至軸突及其分支,也從支配的靶組織中攝取營養以維持其正常代謝,有效的軸漿運輸必須依賴于完整的神經通路.細胞膜熒光探針 Fast DiO 是一種親脂性熒光探針,可通過細胞膜進入纖維末梢,然后經過軸漿運輸達到胞體的熒光探針.與膜結合或者與親脂性生物分子結合時,其熒光強度顯著增強.這種熒光探針可以被神經末梢吞噬,通過逆向軸漿運輸到胞體,但是被吞噬后的熒光探針不能從細胞內釋放出細胞[3],因此是研究中樞核團中是否存在直接投射的理想工具.

Sherin et al[10]發現 TMN 腦區有 GABA 能神經細胞末梢,推測此神經末梢來自 VLPO.本研究在 TMN腦區注射 Fast DiO 熒光探針后,在 VLPO 神經細胞內檢測到綠色熒光信號,表明 VLPO 肯定有神經纖維投射至 TMN.另外,在 VLPO 腦區注射 Fast DiO熒光探針后,在 TMN 神經細胞內也能夠檢測綠色熒光信號,表明 TMN 也有神經纖維直接投射至 VLPO腦區.研究[11]顯示 VLPO 神經細胞可通過抑制TMN 神經細胞的活動產生促睡眠效應.以上研究結果顯示 VLPO 核團與 TMN 核團存在雙向聯系,進一步支持 Saper et al[5]提出的 flip-flop 模型假說.

參考文獻

[1]Gervasoni D,Peyron C,Rampon C,et al. Role and origin of theGABAergic innervation of dorsal raphe serotonergic neurons[J].Neurosci,2000,20\\(11\\) : 4217 - 25.

[2] Ko E M,Estabrooke I V,McCarthy M,et al. Wake-related activ-ity of tuberomammillary neurons in rats[J]. Brain Res,2003,992\\(2\\):220 -6.

[3] Zaidi F N,Whitehead M C. Discrete innervation of murine tastebuds by peripheral taste neurons[J]. Neurosci,2006,26\\(32\\):8243 - 53.

[4] Paxins G,Watson C. The rat brain in stereotaxic coordinates[M]. San Diego:Academic Press,2007.

[5] Saper C B,Chou T C,Scammell T E. The sleep switch: hypotha-lamic control of sleep and wakefulness[J]. Trends Neurosci,2001,24\\(12\\):72631.

[6] Chou T C,Bjorkum A A,Gaus S E,et al. Afferents to the ventro-lateral preoptic nucleus[J]. J Neurosci,2002,22\\(3\\):97790.

[7] Brown R E,Stevens D R,Haas H L. The physiology of brain his-tamine[J]. Prog Neurobiol,2001,63\\(6\\):637 - 72.

[8] Haas H L,Panula P. The role of histamine and the tuberomammil-lary nucleus in the nervous system[J]. Nat Rev Neurosci,2003,4\\(2\\): 121 - 30.

[9]Liu Y W,Li J,Ye J H. Histamine regulates activities of neuronsin the ventrolateral preoptic nucleus[J]. J Physiol,2010,588\\(21\\):4103 - 16.

[10]Sherin J E,Elmquist J K,Torrealba F,et al. Innervation of hista-minergic tuberomammillary neurons by GABAergic and galaniner-gic neurons in the ventrolateral preoptic nucleus of the rat[J]. JNeurosci,1998,18\\(12\\):4705 - 21.

[11] 吳 芳,張 瑾,王烈成,等. 下丘腦腹外側視前區通過抑制結節乳頭體核對大鼠睡眠覺醒進行調控[J]. 中華行為醫學與腦科學雜志,2014,22\\(2\\):97 -100.