長骨的生長是一個軟骨內成骨的過程，在長骨的生長板，軟骨的增殖、肥大以及基質的合成都導致新軟骨的形成，同時在生長板的干骺端，新生的血管和骨細胞前體進入軟骨肥大細胞帶和礦化或非礦化的軟骨基質區，促使軟骨轉變為成骨。 長骨的縱向生長速度主要是由軟骨的形成速度所決定的。而軟骨的形成受多種內分泌和旁分泌因子的調節。有證據顯示：在長骨的生長過程中，胞外鈣在調節生長板的軟骨細胞功能時起到重要作用。 研究發現：鈣和維生素 D 不足會導致生長板的礦化受損。

研究已經證實胞外鈣發揮其生理學功能是通過激活其受體———鈣敏感受體 （calcium sensing receptor，CaSR）來實現的。 CaSR 是一個 G 蛋白偶聯受體，表達于哺乳動物的大多數組織中， 如甲狀旁腺、骨骼、乳腺、腎臟等。 也表達于長骨生長板的增殖帶和肥大帶。 CaSR 基因敲除的小鼠顯示生長延遲，這說明 CaSR 具有促進骨骼生長的作用。 然而這種基因敲除的小鼠表型復雜，包括甲狀旁腺功能亢進、高鈣血癥、低磷血癥，可能掩蓋了 CaSR 對骨骼的直接作用。為了證實 CaSR 是否調節生長板的軟骨形成以及促進長骨的生長。 本研究采用骨骼移植的方法將出生后 3 d 同窩的野生型（WT）和 CaSR 基因敲除（CaSR－ ／－）小鼠的股骨、脛骨移植至同父母來源的 8 周齡野生型（WT）小鼠的背闊肌中。移植骨生長4 周后，取出股骨和脛骨進行 X 線和組織學分析。

1、 材料和方法

1．1 材料

選 用 C57BL／6J 出生后 3 d 同窩的 WT 和CaSR－ ／－小鼠以及與該小鼠同父母來源的 8 周齡 WT小鼠各 6 只（從加拿大 McGill 大學引進，飼養于南京醫科大學動物中心），雌雄不限。

1．2 方法

1．2．1 動物基因型的鑒定

取出生當天的小鼠鼠尾用苯酚－氯仿－異戊醇的方法提 DNA。 然后通過 PCR 進行基因型鑒定。

CaSR 的正向 引物序列為 ：5′ -TCTGTTCTCTTTAG-GTCCTGAAACA-3′ ， 反 向引 物為 ：5′ -TCATTGAT-GAACAGTCTTTCTCCCT-3′，Neo 的正向 引物為 ：5′-TCTTGATTCCCACTTTGTGGTTCTA-3′ ， 反向引物序列同 CaSR 的反向引物序列。 所有引物均由美國Invitrogen 公司合成。Taq 酶（大連寶生物有限公司）。

PCR 反應條件 ：94℃ 預 變 性 4 min，94℃ 解鏈 30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸 30 s。 共進行 30 個循環 。72℃延伸 10 min。 使用 Bio-Rad Mycycler PCR 擴增儀。 CaSR 的擴增產物為 221 bp，Neo 擴增產物為276 bp。 只有 CaSR 擴增條帶的為野生型（WT），只有Neo 擴增條帶的為純合子（CaSR－ ／－），既有 CaSR 擴增條帶，又有 Neo 擴增條帶的為雜合子。 本試驗中使用的是 WT 和 CaSR 純合子（CaSR－ ／－）小鼠（圖1）。

1．2．2 骨移植

取 C57BL／6J 來源的出生后 3 d 同窩的 WT 和CaSR－ ／－小鼠左側的股骨和脛骨，移植至與該小鼠同父母來源的 WT 小鼠的背闊肌中。 左側背闊肌移植WT 小鼠的股骨、 脛骨， 右側移植 CaSR－ ／－小鼠的股骨、脛骨。 移植骨在背闊肌中生長 4 周。

1．2．3 取材

將 3 d 的 WT、CaSR－ ／－小鼠左側的股骨、脛骨和生長 4 周的移植骨取出，放在多聚甲醛－賴氨酸－過碘酸鈉固定液中固定，常規脫鈣，脫水，石蠟包埋，然后切片做組織學染色。

1．2．4 X 線攝影

未脫鈣的 WT 和 CaSR－ ／－小鼠的股骨、脛骨使用Faxitron model 805 radiographic inspection system（Faxitron Contact 公司， 德國） 進行攝片 （電壓 22kV， 曝光時 間 4 min）。 底片 使用 X-Omat TL film（Eastman Kodak 公司，美國），常規方法進行顯影定影。 使用 HP 掃描儀掃描分析。

1．2．5 HE 染色

石蠟切片常規脫臘水化，蘇木素（Sigma 公司，美國）染色，1％鹽酸酒精分色，流水沖洗返藍，伊紅（Sigma 公司，美國）復染，常規脫水透明 ，中性樹膠封片。

1．3 統計學方法

所有染色均由 Leica 數碼顯微鏡拍攝， 并用Northern Eclipse 圖像分析軟件進行定量分析。 數據使用 SPSS15．0 軟件進行組間單因素方差分析，P≤0．05 為差異具有統計學意義。

2、 結 果

2．1 CaSR 缺失對股骨、脛骨生長的影響

為了驗證 CaSR 缺失是否會引起長骨長度的改變， 通過 X 線檢測了生后 3 d 以及骨移植 4 周后的WT 和 CaSR－ ／－小鼠的股骨和脛骨的長度。結果顯示：出生后 3 d，CaSR－ ／－小鼠的股骨、 脛骨長度相對于WT 小鼠明顯縮短 （P ＜ 0．05）。 移植 4 周后，WT 和CaSR－ ／－小鼠的股骨、 脛骨相對于出生后 3 d 時均顯著增長（P ＜ 0．001，P ＜ 0．05），但 WT 小鼠增長的幅度遠遠大于 CaSR－ ／－小鼠增長的幅度（圖 2）。 這說明CaSR 具有促進長骨縱向生長的直接作用。

2．2 CaSR 缺失對軟骨生長的影響

為了研究 CaSR 缺失是否對軟骨生長產生影響，通過石蠟切片 HE 染色對股骨生長板的長度、生長板的增殖帶和肥大帶進行觀察。結果顯示：無論是在出生后 3 d 還是移植后 4 周，WT 和 CaSR－ ／－小鼠股骨生長板的長度兩者之間沒有明顯差異， 但是 4周時股骨生長板相對于 3 d 時的生長板顯著縮短（P＜ 0．05）。 這可能與 4 周時長骨的縱向生長已經減弱或停止，生長板在骨生長中的作用逐漸減弱有關。但從生長板肥大細胞帶的長度可以看出： 無論是 3 d還是移植后 4 周，CaSR－ ／－小鼠的肥大細胞帶均顯著寬于 WT 小鼠（P ＜ 0．001）。 移植 4 周后，WT 小鼠股骨肥大細胞帶要顯著小于出生后 3 d 時 WT 小鼠的肥大細胞帶（P ＜ 0．001）；但是移植 4 周后，CaSR－ ／－小鼠股骨肥大細胞帶比出生后 3 d 時 CaSR－ ／－小鼠的肥大細胞帶顯著增寬（P ＜ 0．001，圖 3）。

3 、討 論

先前 Garner 等對 WT 和 CaSR－ ／－小鼠的骨骼表型做了詳細分析， 發現敲除甲狀旁腺中的 CaSR基因將導致甲狀旁腺功能亢進、高鈣血癥、低磷血癥以及骨骼中的 PTH 過量表達，而且 CaSR 基因敲除的小鼠顯示出骨骼生長的延遲，其軟骨發育不全，增加礦化骨的形成和骨吸收， 不能糾正 CaSR 缺失引起的骨骼表型異常。 而且，這類小鼠最主要的骨骼異常就是佝僂病。 這說明 CaSR 具有促進骨骼生長的作用。 但它并不能反映 CaSR 對骨骼生長的直接作用。 因為 CaSR 基因敲除小鼠其表型很復雜，包括：甲狀旁腺功能亢進、高鈣血癥、低磷血癥。 這些原發或繼發性的作用掩蓋了 CaSR 對骨骼的直接作用。 為了證實 CaSR 是否調節生長板的軟骨形成以及促進長骨生長，本研究采用骨骼移植將出生后3 d 同窩的 WT 和 CaSR－ ／－敲除小鼠的股骨、脛骨移植至同父母來源的 8 周齡的 WT 小鼠背闊肌中。 移植骨生長 4 周后，取出股骨和脛骨進行 X 線和組織學分析。

在出生后 3 d，WT 小鼠的股骨、 脛骨長度比 CaSR－ ／－小鼠的股骨、脛骨長，這可能是因為 CaSR 缺失直接導致了長骨生長的延滯，也可能是由于甲狀旁腺功能亢進使得甲狀旁腺激素分泌過多從而抑制骨骼的生長。

為此，本研究采用骨骼移植的方法給 CaSR－ ／－小鼠骨骼的生長提供一個與 WT 小鼠骨骼生長相同的環境。 移植 4 周后，雖然 WT 和 CaSR－ ／－小鼠的長骨都有增長，但 WT 小鼠的增長幅度遠遠大于 CaSR－ ／－小鼠。 這說明 CaSR 的缺失可以直接抑制骨骼生長。

長骨的生長過程是一個軟骨內成骨的過程。 那么 CaSR 缺失抑制長骨的生長是否是通過影響軟骨的形成來實現呢? 為此研究了生長板的軟骨細胞。

HE 染色顯示無論是出生后 3 d 還是移植后 4 周，生長板的總長度在兩種基因型小鼠（WT 和 CaSR－ ／－）之間沒有明顯差異，但在移植后 4 周時，兩種基因型小鼠的生長板長度要比生后 3 d 時短， 這主要是與移植 4 周以后，移植骨的骨齡已趨成年化，長骨的縱向生長已停止或減弱，軟骨細胞的功能減弱有關。 雖然生長板的總長度在兩種基因型小鼠之間沒有明顯差異，但軟骨肥大細胞帶卻有明顯差異，無論是在出生后 3 d，還是在移植后 4 周，CaSR－ ／－小鼠的軟骨肥大細胞帶明顯寬于 WT 小鼠；在 WT 小鼠中，移植后4 周的肥大細胞帶要小于出生后 3 d， 而在 CaSR－ ／－小鼠中，移植 4 周后的肥大細胞帶要寬于出生后 3 d。

CaSR 在生長板中的表達主要位于生長板的增殖帶和肥大細胞帶。 所以 CaSR 缺失以后，軟骨肥大細胞帶增寬，骨長度縮短，這說明 CaSR 缺失使得軟骨肥大細胞向成骨細胞礦化、骨化能力降低，軟骨細胞聚集在肥大細胞帶，從而使肥大細胞帶增寬。

為了完全了解 CaSR 對骨和軟骨功能的直接作用，糾正甲旁亢是必須的。 因為 CaSR－ ／－新生小鼠致死率很高，從而掩蓋了成年鼠中 CaSR 的骨骼作用。

最近，有兩個研究小組利用了雙敲模型，Tu 等利用 CaSR 與 Gcm2 雙基因敲除，Kos 等利用 CaSR和 PTH 雙基因敲除，成功糾正了甲旁亢以及與之伴隨的高鈣血癥和低磷血癥。在雙敲模型中，小鼠骨骼沒有明顯異常，這說明：在骨骼分化和重建過程中，CaSR 并非是必不可少的。 但這并不能否認 CaSR對骨骼的作用。因為對于維持細胞的正常功能來說，鈣的調節是最基本的，CaSR 的缺失可能導致其他代償途徑， 其中一個代償機制就是骨細胞中 CaSR 剪切變體的表達。 這些受體存在于骨骼中，對胞外鈣濃度的改變以及機械應力的改變具有反應。

而且有人報道存在另一種不同于 CaSR 的 G 蛋白偶聯受體。 所有這些可能解釋以上雙敲小鼠骨骼表型沒有改變的現象。

影響軟骨內礦化和骨化的因素很多， 包括多種激素和調節因子，通過影響軟骨細胞分化速度、軟骨細胞間信號轉換、 軟骨細胞肥大以及軟骨細胞所表達的特有基質類型等來協調軟骨基質的鈣化、 礦化和骨化過程。 這些激素和調節因子之間又存在相互作用，并通過復雜的反饋機制對靶器官產生作用。因此， 本研究只揭示 CaSR 對軟骨細胞的作用主要集中于軟骨細胞的肥大向礦化的過程中， 至于 CaSR對軟骨細胞礦化、 骨化影響的具體機制還需進一步的研究。