上顎腺\\( mandibular gland\\) 是昆蟲重要的外分泌腺,位于昆蟲頭內兩側,為一對囊狀腺體,與上顎相連,開口于上顎基部 \\( Snodgrass,1956; Cruz-Landim and Mello,1967\\) ,一般分為分泌部和儲存囊2 部分 \\( Vallet et al.,1991; Lensky and Cassier,1995\\) 。上顎腺的分泌活動以及腺體功能同蜜蜂的蜂型以及年齡有關 \\( Gracioli-Vitti and Abdalla,2006\\) ,其產生的化學物質在昆蟲的種內信息交流中起重要作用。
關于蜜蜂科上顎腺的結構、發育以及功能,國內外學者進行過許多研究。杜蘭芝和張曉萍\\( 1990\\)對中華蜜蜂 Apis cerana cerana 上顎腺超微結構的比較研究表明,成年工蜂的上顎腺呈囊狀,胞內管和胞外管的管壁由 3 層結構組成,上顎腺細胞的超微結構與咽下腺類似。無刺蜂 Melipona bicolor bicolor 不同蜂型的上顎腺在大小和功能上都有差異: 蜂王的上顎腺最發達,能產生大量的“蜂王物質”,在蜂群中起信息素的作用; 工蜂其次; 而雄蜂的上顎腺最不發達,退化成小囊 \\( Gracioli-Vitti and Silva deMoraes,2002\\) 。麥蜂 Scaptotrigona postica 工蜂和雄蜂的上顎腺在組織結構上沒有明顯差異,但是腺體細胞的超微結構在不同性別和年齡存在差異\\( Gracioli-Vitti and Abdalla,2006\\) 。麥蜂 Meliponaquadrifasciata anthidioides 的上顎腺是由上顎內陷形成的,在預蛹早期就已經開始分化\\( Cruz-Landim andMello,1967\\) 。此外,在蜜蜂蜂群中,工蜂的行為不只受到產卵蜂王上顎腺分泌物的影響,還受到不同年齡未受精蜂王的影響\\( Wossler et al.,2006\\) 。但是關于中華蜜蜂三型蜂上顎腺組織形態的比較以及胚后發育狀況未見報道。
本研究通過組織形態學、BrdU \\( 5-bromo-2-deoxyuridine\\) 免疫組織化學 \\( BrdU incorporation\\) 技術,對中華蜜蜂 A. c. cerana 不同蜂型上顎腺的組織結構以及工蜂上顎腺胚后發育的過程進行了比較研究,為昆蟲上顎腺的結構和功能研究以及昆蟲社會行為的研究提供一定的理論依據。
1、 材料與方法
1. 1 供試材料
實驗所用的中華蜜蜂蛹及成蟲均購自秦嶺大峪中華蜜蜂養殖基地,所取材料來自同一蜂群,包括: 1 -2日齡預蛹\\( PP1 -PP2\\) ;1 -9 日齡蛹\\( P1 - P9\\) ; 成蟲包括采集工蜂,處女蜂王和產卵蜂王,以及未交配雄蜂。
1. 2 蘇木精-伊紅染色\\( hematoxylin-eosin staining,HE 染色\\) 組織化學方法
中華蜜蜂工蜂、蜂王、雄蜂的成蟲各 3 ~5 頭,取頭部,多聚甲醛 4℃固定過夜。梯度酒精脫水,二甲苯透明。石蠟包埋,橫向連續切片,切片厚度 5 ~ 7μm,切片裱于涂有多聚賴氨酸的載玻片上,烘干備用。切片脫蠟后復水,HE 染色,OLYMPUS\\( BX51\\)顯微鏡觀察拍照。
1. 3 BrdU 免疫組織化學方法
1. 3. 1 BrdU 摻入處理: 取中華蜜蜂工蜂的預蛹、1- 9 d 蛹和成蟲活體各 3 ~ 5 頭,從頭部觸角基部注射約 3 μL 濃 度 為 25 mg/mL 的 BrdU \\( B9002,Sigma\\) ,摻入時間為 8 h。
1. 3. 2 BrdU 免疫組織化學染色: 將 BrdU 處理過的預蛹及蛹和成蟲取頭部,4% 多聚甲醛 4℃固定 8h。70% ,80% ,90% ,95% 和 100% 梯度酒精脫水,石蠟包埋,橫向連續切片,厚度為 7 μm。切片裱于涂有多聚賴氨酸的載玻片上,烘干備用。
切片用二甲苯脫蠟,入梯度酒精復水; 抗原修復,磷酸鹽緩沖液\\( phosphate buffered saline,PBS\\)洗 3 次; 3%過氧化氫封閉內源性酶 10 min,Tris-HCl緩沖液\\( Tris-HCl buffered saline,TBS\\) 洗 3 次; 滴加正常山羊血清封閉液,37℃ 30 min; 滴加小鼠 BrdU單克隆抗體\\( 1/200\\) \\( ab8039,ABCAM\\) ,濕盒中4℃孵育過夜,PBS 洗 3 次。滴加生物素化山羊抗小鼠IgG,37℃ 120 min,PBS 洗 3 次; 滴加過氧化物酶37℃ 孵育 30 min,PBS 洗 3 次; 二氨基聯苯胺 \\( 3,3’-diaminobenzidine,DAB\\) 顯色后鏡檢,中性樹膠封片,Nikon 數碼顯微成像系統\\( DS-5M\\) 拍照。陰性對照以 PBS 代替一抗。
1. 4 數據統計與分析
1. 4. 1 細胞計數: 為了評價上顎腺在發育過程中細胞的增殖情況,對切片上 BrdU 標記的增殖細胞\\( 8 h摻入\\) 的數量進行計數\\( 7 μm 切片\\) 。通常切片上標記的細胞核的數量同細胞的數量是成比例的,比例系數依賴于切片的厚度,細胞的大小、形狀以及核的方位。校正公式為 C =c[t/\\( t +d\\) ],C 是校正數,c 為原始數 據,t 為 切 片 厚 度,d 是 細 胞 核 的直徑\\( Abercrombie,1946\\) 。每一時間點計數3 ~5 頭蜜蜂的5 ~8 個上顎腺,計算其平均數,誤差值為標準誤\\( SE\\) 。
1. 4. 2 數據分析: 利用 TSView 7 圖像分析軟件測量上顎腺的面積及分泌細胞和細胞核的直徑; 利用Excel 計算平均值及標準誤。
2、 結果
2. 1 中華蜜蜂成蟲上顎腺的組織結構
中華蜜蜂工蜂的上顎腺倒三角形,位于頭的兩側,大顎的上方\\( 圖 1: A\\) 。分泌細胞構成的腔壁和腺腔之間有內膜分隔,腔內充滿分泌物; 腔壁上有氣管孔\\( 圖 1: B\\) 。分泌細胞扁長形或立方形,胞質強嗜堿性,胞核圓\\( 圖1: C\\) 。蜂王的上顎腺長囊狀,面積明顯大于工蜂\\( 圖1: D\\) \\( 表 1\\) 。處女王腺腔中的內膜明顯,由扁平上皮細胞組成; 在內膜和分泌胞壁之間充滿嗜酸性分泌物\\( 圖 1: E\\) ,并零散分布有球形細胞,胞質中有強嗜酸性顆粒\\( 圖1: F\\) ; 分泌細胞立方形,胞核圓; 胞質強嗜堿性,細胞邊緣的胞質中分布有許多小泡; 每個分泌細胞的一端有胞外管通入腺腔; 胞內管明顯\\( 圖 1: F\\) 。產卵王的上顎腺大于處女王\\( 表 1\\) ,外形不規則,具有許多皺褶\\( 圖 1:G\\) ; 分泌細胞肥大,柱狀,胞質嗜酸性; 胞核圓形,染色質顆粒散在核質中; 胞外的腺腔中有分泌顆粒\\( 圖1: H,I\\) ; 每個細胞有胞外管和胞內管\\( 圖 1: I\\) 。雄蜂的上顎腺最小\\( 表1\\) ,橢圓形,較為退化\\( 圖 1: J\\) ;分泌細胞形態不完整或者很不規則,無法測量其大小; 胞核小,球形; 內膜緊貼胞壁\\( 圖1: K,L\\) 。
2. 2 中華蜜蜂工蜂上顎腺的胚后發育在中華蜜蜂幼蟲發育末期,上顎腺的雛形開始出現,具有腺體部和分泌管 2 部分,腺體細胞柱狀,胞核整齊的排列在細胞基部\\( 圖 2: A\\) 。預蛹發育早期\\( PP1\\) ,腺體開始分化,腺細胞和管細胞都在分裂,但是并不活躍\\( 圖 2: B\\) 。到預蛹發育晚期\\( PP2\\) ,上顎腺的體積有所增大,分裂細胞逐漸增多\\( 圖 2: C\\) \\( 圖 3\\) 。到 P1 時,每一個胞核均呈 BrdU反應陽性,說明腺體細胞開始快速增殖\\( 圖 2: D\\)\\( 圖 4\\) ,但是上顎腺的面積增加得并不快\\( 圖 3\\) 。
到 P2 時,上顎腺分泌細胞細胞質增多,細胞體積變大,細胞由多層、散亂、重疊排布變為單層規則排列,數量較少,胞核圓; 內膜與分泌細胞分離,進入腺腔\\( 圖 2: E\\) 。上顎腺細胞的分裂活動一直持續到蛹發育的第 5 天以后\\( 圖 2: F,G\\) 。到蛹發育的第 6天,細胞的分裂活動已經停止,但是面積卻快速增加\\( 圖 2: H\\) \\( 圖 3\\) 。到第 8 天時,上顎腺的形狀已經類似于成蟲,但是腺腔中沒有分泌物\\( 圖 2: I\\) 。
3、 討論
3. 1 蜜蜂上顎腺的組織結構及功能比較
上顎腺是蜜蜂重要的外分泌腺,蜂王上顎腺的分泌物———蜂王上顎腺信息素\\( queen’s mandibulargland pheromone,QMP\\) 在蜂群生活中有重要的調控作用\\( Snodgrass,1956\\) 。中華蜜蜂三型蜂的上顎腺在腺體大小和分泌細胞的形態上,差異非常顯著\\( 表 1\\) 。蜂王的上顎腺最大; 其次是工蜂; 雄蜂最小,退化成小囊狀。這同其他蜜蜂種類類似\\( Cruz-Landim and Mello,1967; Gracioli-Vitti and Silva deMoraes,2002\\) 。中華蜜蜂產卵王的分泌細胞肥大,并且具有大的胞核,其中散布有明顯的染色質,說明了它們具有旺盛的分泌活動; 雄蜂的上顎腺很小,并且有退化的趨勢,是由于它們的分泌物少,只在同蜂王的婚飛交配時起作用的緣故\\( Lensky et al.,1985\\) 。
蜜蜂上顎腺的分泌活動以及腺體功能具有級型和年齡依賴性。中華蜜蜂的工蜂和蜂王羽化后,上顎腺即開始分泌活動,分泌物通過胞外管直接注入腺體壁和內膜之間的空間積累起來。本研究結果顯示,中華蜜蜂工蜂和剛羽化的處女王上顎腺分泌細胞的形態比較相似,胞質中都含有大量的嗜堿性顆粒,并且都聚集在胞內管的周圍,說明了它們在分泌功能上較為相似。Gracioli-Vitti 等\\( 2005\\) 對無刺蜂M. bicolor 的工蜂和處女王上顎腺的分泌物成分進行的比較研究也顯示,它們的成分較為相似,含量最高的都是 10-羥基-2-癸烯酸[\\( E\\) -10-hydroxydec-2-enoic acid,10-HAD]。一般認為,工蜂上顎腺中的10-HDA 主要是作為蜜蜂幼蟲的食物,此外還與采集有關,并且可以作為誘導信息素參與調節工蜂開始擔任采集任務日齡的大小\\( Callow and Johnston,1960\\) ,因此工蜂在成蜂階段,上顎腺始終具有一定分泌功能,在不同職能的個體間差異不大。但是蜂王上顎腺的發育卻同年齡有關,隨著年齡的增長,蜂王即使不交配,上顎腺中的分泌物成分也會發生變化。研究表明,老齡處女王和產卵蜂王上顎腺中含量最高的成分均為 9-羥基-2-癸烯酸\\( 9-hydroxy-2-decenoic acid,9-HDA \\) 和 9-氧-2-癸烯酸 \\( \\( E \\) -9-oxodec-2-enoic acid,9-ODA\\) ,也正是這些成分,執行了 QMP 的主要功能,包括抑制工蜂培育新蜂王;吸引工蜂聚集到蜂王周圍; 刺激新分蜂群采集花粉、培育幼蜂; 推遲工蜂從事巢內活動到巢外活動的行為轉換\\( Pankiw et al.,1996\\) 等。我們在處女蜂王上顎腺細胞邊緣的胞質中看到了有大量的脂滴,也表明了蜂王和工蜂上顎腺在分泌物成分上的差別,那些脂滴儲存了蜂王分泌物中的脂質成分。中華蜜蜂工蜂和蜂王上顎腺的差異同蜜蜂總科\\( Apoidea\\)的其他一些種類類似\\( Gracioli-Vitti et al.,2004\\) 。
但是在 S. postica 工蜂上顎腺的分泌細胞和管腔中,始終都有脂類物質存在,并且不依賴于個體的行為轉變\\( Gracioli-Vitti et al.,2004\\) ,而中華蜜蜂只在處女王中較為明顯,在工蜂和產卵蜂王卻很少看到,這說明了不同的蜜蜂種類其上顎腺分泌物的組成和成分上存在差別。
上顎腺的腺腔中有一層由扁平細胞組成的內膜,在分泌細胞壁和腺腔之間形成一層獨立空間,這個空間承擔了暫時儲存分泌細胞分泌物的功能,而這個功能在 S. postica 工蜂是由分泌細胞中的小管周區域\\( pericanalicular area\\) 來承擔的\\( Gracioli-Vittiet al.,2004\\) 。中華蜜蜂工蜂和雄蜂的內膜不規則,緊靠著分泌細胞壁,之間的空隙較小,尤其是雄蜂,這可能是由于它們的分泌物較少的緣故。蜂王的這個區域卻比較寬闊,并且充滿了嗜酸性分泌物,但是在腺腔中卻沒有,說明在此時分泌物還沒有進入腺腔,它們只是為后續的分泌活動做準備。此外在腔壁和內膜之間還散布有許多小球形的細胞,這些細胞的胞質中具有大量的強嗜酸性顆粒,類似于小型的脂肪體細胞,這種細胞在工蜂和雄蜂很少看到,它們的功能可能是儲存分泌細胞的分泌物。但是關于這種細胞在其他的昆蟲類型沒有見到報道,其功能還需進一步的實驗研究證明。
中華蜜蜂同西方蜜蜂在上顎腺的面積和分泌細胞的大小上差別較大。中華蜜蜂工蜂上顎腺的面積\\( 約為 135 000 μm2\\) 小于西方蜜蜂 Apis mellifera\\( 約為 302 000 μm2\\) ; 分泌細胞的大小\\( 工蜂為 20 ~ 30μm,蜂王為 40 ~ 60 μm\\) 也小于西方蜜蜂\\( 工蜂為40 ~ 70 μm,蜂王為 50 ~ 90 μm\\) \\( Salles and Cruz-Landim,2004\\) 。這一方面是由于中華蜜蜂的個體本身小于西方蜜蜂,另一方面可能同它們的功能差異有關: 中華蜜蜂不采集和利用蜂膠 \\( 楊冠煌,1973\\) ,所以工蜂的上顎腺也就不分泌西方蜜蜂工蜂分泌物中含有的溶解蜂膠的物質; 同時由于中華蜜蜂的產漿力遠遠不如意蜂,所以上顎腺中分泌的參與王漿組份的一些生物激素也較少。此外中蜂蜂王的上顎腺也小于西方蜜蜂,這也可能是造成中蜂相較于西方蜜蜂,蜂群較為松散,分蜂性強以及失王后工蜂更易產卵\\( 楊冠煌,1973\\) 等的原因之一。
3. 2 中華蜜蜂上顎腺胚后發育的特點
中華蜜蜂的上顎腺最早出現是在幼蟲發育末期,分化和生長從預蛹早期開始,細胞分裂的高峰期出現在蛹發育早期\\( P1 - P3\\) ,尤其在蛹發育的第 1 天,在這個時期,細胞排列成多層,幾乎所有的細胞都在快速增殖,上顎腺的體積也在不斷增加,胞外管開始出現。上顎腺的早期發育特點同蜜蜂屬的其他種類類似\\( Lensky and Cassier,1995; Salles and Cruz-Landim,2004\\) 。在無刺蜂 M. quadrifasciata anthidioides 蛹發育的中期,上顎腺狹長腺體的前背側,有一些細胞會從上皮層分離出來,形成獨立的分泌細胞\\( Cruz-Landim andMello,1967\\) ,這同蜜蜂屬種類由腔壁細胞直接分化形成分泌細胞的方式有較大差別。
在中華蜜蜂上顎腺的發育過程中,上顎腺的體積會不斷增加,但是體積增加的原因卻有所不同。在蛹發育早期\\( P1 - P4\\) ,上顎腺體積的增加主要是基于細胞的快速分裂,而無刺蜂種類則主要是來源于細胞體積的增加\\( Cruz-Landim and Mello,1967\\) 。
到了蛹發育的晚期\\( P5 以后\\) ,中華蜜蜂上顎腺體積的增加也主要來源于分泌細胞體積的增加,此外還和細胞排列方式的改變有關,此時細胞由多層變為單層排列,因此,上顎腺在這個時期體積增加較為迅速。從組織切片上看,中華蜜蜂上顎腺的發育是從下往上進行的,下部靠近上顎的部分細胞較早停止增殖\\( P4\\) ,而上部則在 P6 以后才逐漸停止分裂。
在工蜂羽化時,上顎腺的發育基本完成。工蜂從巢內工作到出房采集的過程中,上顎腺的外部形態以及面積基本保持不變 \\( Gracioli-Vitti and Abdalla,2006\\) 。此外在中華蜜蜂上顎腺的胚后發育過程中,未觀察到細胞的凋亡。蜜蜂上顎腺內膜的形成過程較為特殊,它在蛹發育的第 1 天就已經開始出現,從組織結構上看,是許多腺體壁細胞胞質向管腔中延伸,細胞膜聯合在一起所形成的,在延伸的胞質中充滿了空泡。最初形成的膜光滑而平整,逐漸地它們和腔壁細胞的距離加大,形成波浪狀。到蛹發育的第 5 天,胞膜連同胞核一起從腺體壁上分離下來,成為獨立的內膜細胞,整個細胞變得扁平,胞核小,圓球形。到蛹發育的末期,內膜細胞核變得扁平,但是依然緊挨著分泌細胞形成的腔壁,這個過程同 Vallet 等\\( 1991\\) 對西方蜜蜂的研究一致。BrdU 標記實驗沒有顯示內膜細胞的分裂增殖,推測它們可能是由腔壁細胞分化、遷移而形成的。在分泌細胞和內膜之間能看到大量的胞外管,但是在內膜外的腺腔中卻看不到,說明內膜對胞外管有阻隔的作用。在蜜蜂上顎腺開始形成分泌物時,分泌物會從胞外管注入分泌細胞和內膜之間的空間暫時儲存起來,等到蜜蜂成熟以后,它們才會進入分泌腔,并被分泌到外界去。
