腎上腺皮質細胞移植對治療各種原因引起的腎上腺皮質功能不全具有廣闊的應用前景，但研究中發現皮質細胞再生不完全，產生的皮質激素也不能完全滿足生理需要。內皮素\\(ET\\)-1是最強的縮血管物質之一，具有促進多種組織細胞增殖與分泌的作用，在體內可增加大鼠腎上腺自體移植物的增殖和分泌。本文通過研究ET-1對體外培養的大鼠腎上腺皮質細胞增殖與分泌的影響，進一步探討大鼠腎上腺細胞體外培養時的生長特性，以期優化腎上腺皮質細胞體外培養方案，為腎上腺細胞移植提供最適宜的條件。
1、材料與方法
1.1材料
2周齡SD大鼠\\(汕頭大學醫學院實驗動物中心提供\\)30只，膠原酶I型\\(Sigma公司，美國\\)，DNA酶I型\\(LABEST公司，北京\\)，DMEM∕F-12培養基、胎牛血清，原代消化液\\(DMEMF-12培養基配制，內含1mg/mL膠原酶I型、5μg/mLDNA酶I型\\)，培養瓶、培養皿、手術器械，ET-1\\(Enzo公司，美國\\)，鼠抗人PCNA單克隆抗體\\(武漢博士德生物技術有限公司，中國\\)，SP-9002免疫組化染色試劑盒\\(北京中杉金橋公司，中國\\)，皮質酮放免法試劑盒\\(中國原子能研究院同位素研究所，中國\\)。
1.2原代培養大鼠腎上腺皮質細胞
取大鼠腎上腺，剪碎后置于消化液\\(1g/L膠原酶I型，5mg/LDNA酶I型\\)中消化，并接種于培養皿中原代培養，12d后傳代。取傳代培養對數生長期大鼠腎上腺皮質細胞，制成細胞懸液，等濃度接種于96、12孔板，分別進行MTT法及免疫組化實驗。
1.3ET-1對細胞增殖與分泌的影響
MTT法：取對數生長期細胞，調整細胞濃度為5×104/mL，每孔100μL接種于96孔板中，共接種88孔，分11組\\(10個實驗組，1個對照組），每組8孔。過夜后棄上清液，10個實驗組分別加入含10倍濃度\\(10-6~-15mol/L\\)梯度的ET-1培養基，對照組8孔換不含ET-1培養基。繼續培養36h后以MTT法檢測各孔吸光度值。
實驗重復5次，計算各組平均吸光度值。免疫組化及放射免疫法：等細胞濃度傳代培養于12孔板中，培養板各孔預先放置無菌玻片。一次接種2個培養板，共24孔，分6組\\(5個實驗組，1個對照組），每組4孔。培養箱中過夜后棄上清液，5個實驗組分別加入含10倍濃度\\(10-8~-12mol/L\\)梯度ET-1培養基，對照組4孔換不含ET-1培養基。完成后每天顯微鏡觀察各孔細胞生長狀況，或有無明顯生長速度差別。于第5d終止培養，吸取各孔培養液留EP管，以放射免疫法檢測各孔皮質酮濃度，計算各組均值。吸出培養液后取出各孔玻片，以細胞爬片免疫組化檢測細胞增殖因子\\(PCNA\\)的表達，圖像軟件分析染色的陽性細胞個數，以平均光密度值來表示細胞染色的陽性率。
1.4統計學處理
采用SPSS19.0統計軟件包進行統計學處理，實驗數據以x±s表示。各組間吸光度值以及皮質酮濃度比較采用方差分析及兩兩比較的SNK檢驗，細胞PCNA陽性率采用卡方檢驗。
2、結果
2.1大鼠腎上腺皮質細胞原代培養
兩組腎上腺細胞原代培養的細胞形態相似，胞體呈圓形或多角形，胞體大，細胞質透亮，內有許多大小較為規則的顆粒。實驗觀察在同批次等細胞濃度接種條件下，ET-1濃度10-10~-12mol/L組比對照組增殖速度更快，傳代時間更短\\(圖1，封1\\)。
2.2MTT法檢測ET-1對細胞增殖的影響
隨著培養液中ET-1濃度的升高，接種于96孔板中的10組細胞，吸光度值呈一單峰波形。在第6組\\(10-10mol/LET-1\\)處取得最高值，單因素方差分析結果顯示各組間差異有統計學意義\\(P<0.01\\)。采用SPSS軟件行SNK各組均數間的多重比較，發現處于波峰的6、7組\\(10-10~-11mol/L組\\)吸光度值與1~4，8~10組比差異有統計學意義\\(P<0.05\\)\\(圖2\\)。
2.3PCNA的表達及培養液中皮質酮濃度
接種于24孔板的6組細胞，免疫組化檢測的PCNA表達率與放射免疫法檢測的皮質酮濃度呈大體一致的升降趨勢\\(表1\\)，在10-10~-11處取得最高峰值，單因素方差分析結果顯示各組間差異有統計學意義\\(P<0.01\\)。采用SPSS軟件行SNK各組均數間的多重比較，發現10-10~-11組與各組比差異均有統計學意義\\(P<0.05\\)。細胞免疫組化圖像見圖3\\(封1\\)。
3、討論
腎上腺細胞體外培養是研究腎上腺細胞移植的第一步。在體外培養條件下可觀察細胞生長、增殖及分泌的特性。本實驗對大鼠腎上腺細胞進行原代培養，培養過程中觀察到加或不加ET-1，細胞增殖及生長速度呈一定差異。進一步研究不同濃度ET-1對細胞的影響，分組檢測細胞增殖因子PCNA的表達，及培養液中皮質激素的濃度，發現在10-10~-11mol/L時，細胞增殖與分泌最旺盛，而且僅在此適宜濃度下才具刺激細胞增殖的作用，在較高或較低濃度下均對細胞增殖無明顯影響。
在體外培養條件下，ET-1能促進在正常情況下分裂增殖能力極弱的黑素細胞的增殖。也可促進大鼠骨髓內皮前體細胞的增殖，促進細胞向s期和G期轉化。在體內試驗中，VENDEIRA等發現ET-1可使腎上腺自體移植大鼠的血漿醛固酮和皮質酮濃度在短時間內顯著增加，結締組織被膜下分泌醛固酮的細胞顯著增生，提示其可能具有促進皮質細胞增生的作用。ROSSI等研究發現，人體腎上腺皮質細胞表達ET-1的兩種受體\\(ETA、B\\)。ET-1通過作用于這兩種受體，可明顯促進糖、鹽皮質激素的分泌，通過ETA受體可促進球狀帶細胞的增殖。而人體腎上腺能以自、旁分泌的形式產生少量ET-1，對腎上腺皮質細胞的功能進行調節。在體外培養條件下，ET-1只有在接近皮質細胞體內正常生理濃度時，才能發揮作用。
這與其他多肽類激素在受體飽和前濃度越高效果越顯著的特點不一樣。這也解釋了這次實驗為什么ET-1只有在適宜濃度\\(10-10~-12mol/L\\)時才具促進皮質細胞增殖與分泌的作用。因此，可以認為ET-1是腎上腺皮質細胞生長代謝的重要調節激素，加入接近體內條件下的ET-1，可有效促進體外培養時皮質細胞的增殖及分泌功能，增加皮質細胞的活力，更有利于后期腎上腺細胞移植的進行。同時其促進球狀帶細胞增殖的作用，有望改善移植后球狀帶細胞不足、鹽皮質激素水平低下的情況。
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