杏仁核又稱杏仁復合體，是邊緣系統的一個重要核團，包含十多個大小不同的核群，并可能作為重要的痛覺信息編碼和調制的大腦中樞,不但在情緒認知記憶方面而且在情感障礙例如焦慮和憂慮方面都起著重要的作用.然而，最近的研究表明，在杏仁核的眾多亞核群中，中央杏仁核（central amygdala, CeA）被認為是與痛覺活動相關的重要核團,它接受傷害性感受信息的傳入，因而被認為是一個傷害性感受核團。CeA 中的大量神經元對傷害性刺激的反應具有“優先和獨立”的特性.CeA 能夠通過脊髓-臂旁核-CeA 痛覺通路接受單純的傷害性信息,并通過這條通路與脊髓和腦干的傷害性感受中樞發生聯系，從而參與內臟痛覺信息的傳遞。但 CeA 是否參與心臟痛覺信息的傳遞并是否對其具有調控作用，尚未見報道。本研究以心包內注射致痛物質誘發大鼠 SPT 放電為指標,通過觀測 CeA 內 c-Fos 表達的變化及不同強度電刺激 CeA 后大鼠背斜方肌肌電反應（EMG）的變化，從而探討 CeA 對大鼠心臟傷害性感受信息的傳遞及調節作用。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 兔抗大鼠 c-Fos 多克隆抗體（美國 abcom 公司）；ABC Kit免疫組化試劑盒（rabbit IgG,美國 Vector 公司）；CAP（美國 Sigma 公司）；常用試劑（本室配制）；冰凍切片機（CM1900,德國 Leica 公司）；Olympus 生物顯微鏡（BX51,日本 Olympus 公司）；刺激器（SEN-3301,日本 Nihon Kohden公司）；隔離器（SS-202J,日本 Nihon Kohden 公司）；大鼠腦立體定位儀（SN-2N,日本 Narishige 公司）；生物信號采集與分析系統（BL-420,成都泰盟生物科技有限公司）。

1.2 實驗動物與分組 實驗選用健康雄性、標準清潔級成年 SD 大鼠，體重 250~300g.隨即分為正常對照組（n=6）、心包內注射生理鹽水組（n=6）、心包內注射 CAP 組（n=6），電刺激 CeA 的強度分別為 30?A 和 70?A（n=6）（心包內注射 CAP 15s 后行 CeA 電刺激）。

1.3 方法

1.3.1 手術 實驗動物稱重后用 20mg/mL 戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，行常規氣管插管和頸靜脈插管，于左側上胸部第 1~3 肋軟骨處行開胸術，暴露胸腺和心臟。將一遠端有數個小洞的硅膠管（長 14~16cm、內徑 0.020cm、外徑 0.037cm）從此孔順胸腺間隙插入心包腔內約 3~4cm,并逐層縫合胸腺和各層胸壁組織。心包內每次可注入的液體量約為 0.2mL 并能完全回吸。實驗動物取俯臥位，暴露左側 SPT,水平插入同芯電極，深度 1.5~1.7mm,用 BL-420 生物機能實驗系統記錄肌電活動。

1.3.2 免疫組織化學方法測定中央杏仁核 c-Fos 的表達 實驗動物用 20mg/mL戊巴比妥鈉深麻后打開胸廓，經主動脈灌流后取出大腦并固定，沉糖后進行腦部冰凍切片，切片厚 40?m.按以下流程依次進行操作：用 3mL/L 的過氧化氫溶液滅活內源性的過氧化物酶，用 0.3%的 PBS-T 通透，用 100mL/L 血清封閉液封閉，加一抗（1∶500,陰性對照實驗中，用 PBS 代替一抗，）、二抗（1∶200）及A/B 液（0.3%的 PBS-T 1∶100,室溫孵育 2h）。DAB 顯色，裱片，脫水，透明，封片，用 Olympus 光學顯微鏡（BX51）及照相軟件 SPOT 對腦部切片進行圖像采集分析。用 Imag-Pro-Plus 軟件計數 CeA 內的 c-Fos 陽性細胞數。每只大鼠 CeA位置取 5 張切片進行 c-Fos 陽性細胞計數并計算均數。

1.3.3 電生理學方法記錄肌電反應 心包內重復注射 CAP 后大鼠背斜方肌 EMG的記錄：記錄正常對照組（即未給予任何處理）的 EMG 1min 作為基線活動，然后心包內注射 CAP（0.01g/L,0.2mL），記錄肌電活動，1min 后回抽，用生理鹽水沖洗心包腔 5~6 次（0.2mL/次），間隔 50min.如此反復 4 次心包內注射CAP.

不同強度電刺激 CeA 后大鼠背斜方肌 EMG 的記錄：CeA 刺激電極置于前囟向尾 2.0~2.2 mm,右旁開 4.0~4.2mm,深度 7~9mm.刺激參數：頻率為 50Hz,波寬為 0.2ms,刺激強度分別為 30?A 和 70?A;刺激時間均為 1min.記錄 EMG基線活動 1min 后，再以心包內注射 CAP（0.01g/L,0.2mL）后記錄的 EMG 活動作為基礎對照，1min 后回抽并用溫生理鹽水沖洗心包腔；間隔 50min 行 CeA電刺激（30?A,15s），15s 后繼續維持電刺激并且心包內注射 CAP（0.01g/L,0.2mL）記錄 EMG,1min 后回抽并沖洗心包腔；間隔 50min 行 CeA 電刺激（70?A,15s），15s 后繼續維持電刺激并給予心包內注射 CAP（0.01g/L,0.2mL），記錄EMG,1min 后回抽并沖洗心包腔。

1.4 統計學處理 計量資料以 x ±s 表示，采用 SPSS 16.0 統計軟件進行分析。

免疫組化采用 one-way ANOVA 并 SNK-q 檢驗進行分析；肌電反應采用重復測量的方差分析。P<0.05 為差異有統計學意義。應用圖形可視化和數據分析軟件SigmaPlot10.0 作圖。

2 結 果

2.1 心包內 CAP 注射對中央杏仁核 c-Fos 表達的影響 統計結果表明，3 組之間有差別，c-Fos 陽性表達量在正常對照組（n=6）為 7.57±1.32,心包內生理鹽水組（n=6）為 12.67±3.21,心包內 CAP 組（n=6）為：90.82±3.24.其中心包內生理鹽水組與正常對照組相比，無統計學差異（P>0.05）。相反，心包內注射CAP 組誘發了 CeA 中大量 c-Fos 表達，其陽性細胞數明顯高于心包內生理鹽水組（P<0.05,圖 1）?！緢D1】


2.2 心包內注射 CAP 誘發的 EMG 具有可重復性 6 只大鼠心包內反復 4 次注射 CAP,每次間隔 50min.統計結果表明，第 2 次到第 4 次心包內注射 CAP 所誘發的 EMG 反應與第 1 次 CAP 刺激所誘發的 EMG（基礎對照，100%）無明顯差別。其標化率分別為（101.67±1.87）%、（99.47±2.37）%、（94.59±1.87）%,差異無統計學意義（P<0.05,圖 2）?！緢D2】


2.3 中央杏仁核電刺激對心包內 CAP 誘發的 EMG 的調節效應 電刺激 CeA的結果顯示，30?A（n=6）電刺激 CeA 后心包內注射 CAP 誘發的 EMG 反應下降至基礎對照值的（78.58±4.62）%（P<0.05）；70?A（n=6）電刺激 CeA 后心包內注射 CAP 誘發的 EMG 反應下降至基礎對照值的（54.89±3.98）%（P<0.05,圖 3）?！緢D3】


3 討 論

內臟中的感受器主要是痛覺感受器，因此內臟感覺主要是痛覺。內臟痛常由擠壓、牽張等機械刺激、炎癥和代謝產物等化學性刺激引起，其特點是疼痛緩慢而持久，定位不準確，以及情緒和自主神經反應等。當冠狀動脈的供血量與心肌的需血量之間發生矛盾，即冠狀動脈血流量不能滿足心肌代謝的需要時，會引起心肌急劇的、暫時的缺血缺氧，即可發生心絞痛。心絞痛的典型表現為陣發性的前胸部壓榨性疼痛感覺，主要位于胸骨后部，同時可以放射到頸部、臂部、顎或牙齒.關于心絞痛發生的信息傳入途徑，一般認為伴隨心臟交感神經的感覺傳入纖維，其末梢廣泛分布于心室肌淺表層、心包膜臟層和部分壁層；傳入纖維組成部分心下神經，經星狀神經節投射至上胸段（T1~T5）脊髓背角，并與體表神經在脊髓內發生會聚聯系，再通過丘腦傳入到大腦皮質而產生痛覺.

已知大腦邊緣皮質的中央杏仁核接受傷害性感受信息的傳入，但迄今為止，有關 CeA 在心臟傷害性感受信息的傳入及調節方面的研究鮮有報道。JOU 等人的研究發現，給大鼠心包內注射致痛物質可誘發 SPT 放電，這可以作為心臟-軀體運動反射（CMR）的指標,即心臟傷害性感受的反應指標，也是作為研究心臟傷害性感受傳入和調控作用的簡單有效的動物模型，藉此探索 CeA 與心臟傷害性感受傳入之間的關系以及電刺激 CeA 對 CMR 的影響。

本研究通過心包內注射 CAP,制備大鼠 CMR 痛覺模型；采用免疫組織化學方法觀察到心包內注射 CAP 可引起 CeA 中 c-Fos（即傷害感受神經元活動的標志物）陽性細胞數量明顯增加，已知觀察 c-Fos 在中樞神經系統的空間表達狀況是探索傷害性感受信息傳入及其神經通路最常用的方法之一,有研究表明，腹腔注射乙酸所致的內臟痛可使 CeA 的 c-fos mRNA 表達顯著增加.在結腸炎痛覺的動物模型中，CeA 的 c-Fos 蛋白表達也均有所增加，說明 CeA 與內臟痛覺之間的確存在密切關系。近來，有研究發現通過對麻醉的老鼠行細胞外單個電位放電記錄，從電生理活動分析了心臟傷害性信息的傳遞，結論顯示 CeA神經元聚集有大量軀體感覺和內臟傷害性信息的傳入信號.刺激貓的牙髓可以在 CeA 的內側部和外側部記錄到對傷害性刺激發生反應的神經元，其反應可以被嗎啡抑制，納洛酮可以逆轉這種抑制作用.從本研究的圖 3 中可知，使用電生理方法研究發現電刺激CeA明顯地抑制了由心包內注射辣椒素誘發的EMG反應，反映 CeA 可能參與了大鼠心臟傷害性感受信息的下行抑制性調控。但關于中央杏仁核參與心臟傷害性感受信息傳遞與調控的神經遞質、受體及其信號轉導機制如何，則有待進一步研究證實。