0、 引言
【研究意義】凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）又名南美白對蝦，是迄今世界養殖產量最高的優良蝦種，因其具有殼薄體肥、肉質鮮嫩、生長迅速、群體生長均勻、抗病力強等優點，深受國內外市場的青睞（林瓊武等，2006；Aloise et al.，2011；彭金霞等，2013）。
開展繁殖生物學研究、完善苗種培育技術及制定人工育苗標準化操作規范，是實現凡納濱對蝦人工規?；庇挠行緩?；而確立不同溫度下受精卵第一、第二極體釋放時間，是開展凡納濱對蝦雌核發育誘導及后續細胞工程育種研究的重要基礎。因此，有必要深入開展凡納濱對蝦的胚胎發育生物學研究?！厩叭搜芯窟M展】隨著國內外對蝦增養殖業的迅猛發展，以提升養殖產量和品質為主要目標的染色體組工程已成為對蝦育種研究的重點領域（Garnica-Rivera et al.，2004；Sellars et al.，2010；Aloise et al.，2011）。目前，有關對蝦胚胎及幼體發育的研究集中在形態描述（García-guerrero and Hendrickx，2009；栗治國等，2013），且發現水溫變化是對蝦繁殖和生長發育的關鍵因素（彭昌迪等，2002），在生長、存活、生理生化和能量代謝等方面均已得到證實（Chen andLai，1993；Wyban et al.，1995；Kumlu et al.，1995；李庭古等，2006）。國內已有學者對紅螯螯蝦、凡納濱對蝦、克氏原螯蝦和脊尾白蝦等的胚胎發育過程進行了觀察和描述（孟凡麗等，2000；彭昌迪等，2002；呂建林等，2006；栗治國等，2013）；國外學者則主要針對羅氏沼蝦和長臂蝦科4種對蝦的胚胎發育進程及發育形態特征進行觀察（Müller et al.，2004；García-guerrero andHendrickx，2009）。有關對蝦雌核發育的研究國內外鮮見報道，僅見國內學者在20世紀90年代進行了一些試驗性嘗試（戴繼勛等，1993；蔡難兒等，1995；陳本楠等，1997），但至今未獲得對蝦雌核發育誘導技術的突破?！颈狙芯壳腥朦c】凡納濱對蝦卵子染色體加倍是雌核發育誘導的兩大技術之一，而受精卵極體釋放時間又是染色體加倍成功與否的關鍵，目前在國外雖有相關研究報道（Garnica-Rivera et al.，2004；Aloiseet al.，2011），但因品種和環境條件差異而尚無定論?！緮M解決的關鍵問題】以廣西水產科學研究院選育獲得并擁有自主知識產權的國審水產新品種（登記號GS-01-001-2012）———凡納濱對蝦“桂海1號”為研究對象，對該品種不同溫度下受精卵發育時序進行觀察，旨在了解凡納濱對蝦胚胎發育的時序及特征，尤其是第一極體和第二極體排出的時間點，為其雌核發育誘導中染色體加倍最佳操作窗口的確定及人工苗種生產提供參考依據。
1、 材料與方法
1. 1 親本來源及孵化用水處理
雌雄親蝦為廣西水產科學研究院國家級SPF南美白對蝦良種場車間內人工培育至性腺成熟的桂海1號，其中，雌蝦體重60.47±1.79 g，體長20.27±0.64 cm；雄蝦體重44.13±2.02 g，體長18.00±0.53 cm。自然海水經暗沉淀、砂濾，雙層棉濾袋過濾兩次后再用濾器過濾3次，并以甲醛和優樂碘分別殺菌，EDTA鈉鹽螯合重金屬離子（彭昌迪等，2002）。
1. 2 胚胎發育觀察
從雌蝦池中挑選已成功交配貼莢的雌蝦（背部暗紅色性腺線條連續且清晰），置于500 L的玻璃圓桶內待產卵，水溫控制在（30.0±0.5）℃，鹽度28.6‰，避光，不充氣，產卵后移走親蝦，并及時采集受精卵進行連續顯微觀察。具體操作：先在直徑4 cm的細胞培養級平皿中用微吸管或槍頭吸取1滴經凈化消毒滅菌的海水（20.0 μL），保持液滴在平皿中不擴散，呈球形液滴，然后吸取細胞培養級礦物油將該海水液滴完全覆蓋，使海水液滴完全包裹于礦物油中，防止揮發擴散。在解剖鏡或光學顯微鏡下，用玻璃毛細管小心挑選吸出3枚正常的受精卵，將其小心移入海水液滴中，隨后調整物鏡，并設置拍照時間進行連續拍照，中途無需添加海水，但需定時觀察確認顯微鏡物鏡鏡頭是否正位，如移位則進行微調（孟凡麗等，2000）。
1. 3 不同水溫下的受精卵孵化試驗
將成功交配的雌蝦每尾單獨置于室內500 L的玻璃圓桶內，水溫控制在（30.0±0.5）℃，促其產卵，試驗用水為凈化處理的潔凈海水，鹽度26.0‰~29.0‰，pH 8.1~8.5。當觀察到雌蝦產卵后，從桶內隨機收集50枚受精卵，分別轉入以水浴控溫在28.0、29.0、29.5、30.0和30.5 ℃的500 mL玻璃燒杯中孵化，每個溫度梯度重復3次。期間定時輕輕攪動水體，使卵子均勻懸浮分布，觀察不同水溫梯度受精卵的孵化情況（彭昌迪等，2002；林瓊武等，2006）。
1. 4 統計分析
以Excel 2003和SPSS 17.0軟件處理試驗數據，并采用Duncan’s單因素方差分析法進行顯著性分析。
2、 結果與分析
2. 1 凡納濱對蝦胚胎發育時序及形態特征
凡納濱對蝦受精卵在水溫30.5 ℃、鹽度28.6‰的條件下，經過11.5~11.8 h完成孵化，幼體陸續破膜而出，其胚胎發育過程詳見表1。凡納濱對蝦的發育屬于直接發育類型，體外受精，體外發育，整個胚胎發育都在卵膜內進行。根據胚胎發育的形態特征變化，可分為7個階段：受精卵期、卵裂期、囊胚期、原腸期、肢芽期、膜內無節幼體期和出膜幼體期。
（1）受精卵期：成熟卵子為橙黃色，呈發散狀從生殖孔排出，產出瞬間為游離態，但粘性很大，接觸海水不久便聚集成團，且具沉性；卵子發生皮層反應，皮層中的周邊體向外擴散，卵子逐漸由不規則變為圓形。周邊體完全溶解消失后，圍卵膜開始突起，瞬間卵子完成第一次成熟分裂，排出第一極體；隨同圍卵膜舉起，1 min后即完成第二次成熟分裂而排出第二極體。
（2）卵裂期：卵子受精后的卵裂方式為完全卵裂，且有螺旋型卵裂的卵子在受精1.0~2.0 h就開始卵裂，先由1個細胞分裂成兩個細胞，再由兩個細胞分裂成4個細胞，以后按幾何級數遞增。
（3）囊胚期：當胚胎發育至32-細胞時，呈圓球形囊胚，植物極的分裂比動物極慢。
（4）原腸期：以內陷方式形成原腸，至64-細胞末期，兩個內胚層母細胞內陷入囊胚中，不久中胚層細胞也出現在囊胚腔中。至128-細胞期 內陷更明顯，背唇外作用最快，胚孔近似三角形，在受精后10.0 h左右形成原腸，胚孔閉合。
（5）肢芽期：胚胎依次出現第二觸角原基、大顎原基及第一觸角原基，此時的胚胎可觀察到3對原基隆起。
（6）膜內無節幼體期：肢芽分化出內外肢，肢端生出剛毛，胚體前端腹面中央出現紅色眼點，胚體在卵膜內逐漸轉動，不久幼體破膜孵出。
（7）出膜幼體期：歷時11.5~11.8 h，在胚體后期發育中卵黃大量損耗，卵黃囊大幅度縮小，孵化時大部分卵黃被吸收；幼體在膜內急劇運動，以身體附生刺和剛毛刺破卵膜，尾部在卵膜最薄處破膜而出，甩掉卵膜進入水中，成為自由生活的無節幼體。出膜后的幼體還含有卵黃囊，出膜32.0 h后幼體開始開口攝食。
2. 2 不同溫度下凡納濱對蝦的胚胎發育進程
由表2可知，水溫變化對受精卵極體的排出和孵化時間有明顯影響，水溫為28.0~30.5 ℃時，受精卵的發育速度隨水溫升高而變快，當水溫由28.0 ℃上升至30.5 ℃時，孵化時間從13.0 h縮短至11.5 h，即水溫每升高1.0 ℃，孵化時間就縮短0.6 h。水溫為28.0~30.5 ℃時，凡納濱對蝦受精卵第一極體釋放時間為7.0~13.0min，第二極體釋放時間為8.0~14.0 min。
試驗過程中重點對29.5和30.5 ℃水溫下凡納濱對蝦受精卵極體排出和第一次卵裂進行觀察，結果發現，在30.5 ℃水溫下凡納濱對蝦受精卵第一次成熟減數分裂（釋放第一極體）的時間為7.0~9.0 min，第二次成熟減數分裂（釋放第二極體）的時間為8.0~10.0 min，第一次卵裂（有絲分裂）的時間為20.0~23.0 min，而在29.5 ℃下各發育階段的時間略有延遲。
2. 3 發育異常受精卵的形態觀察
本研究過程中可觀察到部分異常的受精卵（圖2-1）及停滯發育于多細胞期（圖2-2）、肢芽期（圖2-3）或膜內幼體期的受精卵（圖2-4），還發現有未受精卵發生皮層反應后發生卵裂行為，但形成的分裂球大小不等、形狀各異，即不均等分裂的未受精卵（圖2-5）和停滯發育于原腸胚期的未受精卵（圖2-6）。一般情況下，受精卵是進行正常的完全均等卵裂行為，分裂球界限分明，而未受精卵通常在完成第二次卵裂后即停止發育，且分裂球界限模糊不清。
3、 討論
彭昌迪等（2002）以人工培育成熟的凡納濱對蝦為材料，觀察并描述胚胎發育過程，發現在水溫29.5 ℃、鹽度28‰的條件下，從其卵子產出受精至孵化過程可分為卵裂、原腸胚、肢芽期和膜內幼體等4個階段，整個胚胎發育過程需12 h左右。本研究觀察發現，凡納濱對蝦的受精卵呈豆綠色，直徑0.28~0.30 mm，其發育屬于直接發育類型，體外受精，體外發育，整個胚胎發育都在卵膜內進行；根據胚胎發育的形態特征變化（孟凡麗等，2000；呂建林等，2006），可分為7個階段：受精卵期、卵裂期、囊胚期、原腸期、肢芽期、膜內無節幼體期和出膜幼體期，與彭昌迪等（2002）的研究結果基本一致。
凡納濱對蝦屬變溫動物，水溫高低決定其新陳代謝的速度，同樣胚胎發育速度也直接受水溫影響。彭昌迪等（2002）報道不同水溫對凡納濱對蝦受精卵孵化出膜的時間有顯著影響，水溫從29.5 ℃下降至26.8 ℃，孵化時間從11.3 h增加到15.0 h；最適孵化水溫為28.0~30.0 ℃；在水溫29.5 ℃、鹽度28‰的條件下其受精卵第一、二極體釋放時間分別為7和8 min。栗治國等（2013）報道，在19.0~31.0 ℃的水溫范圍內脊尾白蝦受精卵均可正常發育孵化出幼體，且高溫可明顯加快胚胎發育速率，縮短各期胚胎發育持續時間。由于研究方法和對蝦品種的差異，本研究結果與彭昌迪等（2002）、栗治國等（2013）的研究結果有所不同，但所表現出的變化趨勢基本一致，當水溫由30.5 ℃下降至28.0 ℃，孵化時間從11.5 h增至13.0 h，即水溫每下降1.0 ℃，孵化時間需增加0.6 h；在28.0~30.5 ℃的水溫范圍內，凡納濱對蝦受精卵第一極體釋放時間為7~13min，第二極體釋放時間為8~14 min，胚胎發育需11.5~13.0 h?？梢?，在確保受精卵正常發育的前提下，適當調低培育水溫能延遲胚胎發育速度，為人工誘導卵染色體加倍創造較充足的操作窗口期。
本研究觀察發現有部分發育異常的受精卵，可能由于操作機械損傷或卵過于集中缺氧等，而導致受精卵破裂溶解或停滯發育在多細胞期、肢芽期、膜內幼體期等胚胎發育階段。此外，本研究還發現未受精卵發生皮層反應后發生卵裂行為，但形成的分裂球大小不等、形狀各異，且到達相同分裂期所需的時間比受精卵延遲很多。如水溫為29.0~30.0 ℃時，正常受精卵分裂至2-細胞需25~30 min，而未受精卵需1.5~2.0 h。
一般情況下，受精卵是進行正常的完全均等卵裂行為，分裂球界限分明，而未受精卵通常在完成第二次卵裂后即停止發育，且分裂球界限模糊不清。因此，受精卵是否正常進行完全均等分裂是確定卵子受精與否的重要標準（彭昌迪等，2002；Garnica-Rivera et al.，2004）。該結論為后續判定滅活精子是否成功激活卵子并成功加倍為雌核發育二倍體提供了標準，發育至2-細胞期仍能繼續正常發育的受精卵即為成功誘導的雌核發育二倍體受精卵。
4、 結論
本研究結果表明，在確保凡納濱對蝦受精卵正常發育的前提下，適當調低培育水溫能延遲胚胎發育速度，為人工誘導卵染色體加倍創造較充足的操作窗口期。此外，受精卵是否均等分裂是判斷凡納濱對蝦卵子受精與否的重要標準。
參考文獻：
1.蔡難兒，林峰，柯亞夫，陳本楠. 1995. 中國對蝦人工誘導雌核發育的研究 I———四步誘導法［J］. 海洋科學，（3）：35-41.
2.陳本楠，蔡難兒，李光友. 1997. 中國對蝦人工誘導雌核發育的研究 II. 紫外線輻射對精子頂體反應和受精能力的影響［J］. 海洋科學，（1）：41-47.
3.戴繼勛，包振民，張全啟，劉健. 1993.60Coγ 射線誘導中國對蝦雌核發育的觀察［J］. 青島海洋大學學報，23（4）：151-155.
4.李庭古，羅剛，徐國成，邵營澤. 2006. 不同水溫對克氏螯蝦受精卵孵化的影響［J］. 水產養殖，27（1）：16-17.
5.栗治國，張成松，張巖，李富花，相建海. 2013. 溫度對脊尾白蝦胚胎及幼體發育的影響研究［J］. 海洋科學，37（10）：9-16.
6.林瓊武，艾春香，李少菁，王桂忠，陳學雷，沈綠珠. 2006. 凡納濱對蝦親蝦馴養、促熟、產卵及無節幼體培育［J］. 廈門大學學報：自然科學版，45（5）：688-691.
7.呂建林，龔世園，李浪平. 2006. 克氏原螯蝦胚胎發育的初步研究［J］. 長江大學學報：自然科學版，3（4）：179-182.
8.孟凡麗，趙云龍，陳立僑，顧志敏，徐谷星，劉啟文. 2000. 紅螯螯蝦胚胎發育研究 I. 胚胎外部結構的形態發生［J］. 動物學研究，21（6）：468-472.
9.彭昌迪，鄭建民，彭文國，何世強，唐天禮，王維部. 2002. 南美白對蝦的胚胎發育以及溫度與鹽度對胚胎發育的影響［J］. 上海水產大學學報，11（4）：310-316.
10.彭金霞，蔣小珍，房振峰，殷勤，韋嬪媛，陳曉漢. 2013. 凡納濱對蝦 COPE 基因序列及低溫表達分析［J］. 西南農業學報，26（1）：371-376.
