摘要：數字PCR（Digital PCR,dPCR）是核酸絕對定量的新方法，該技術通過分液，將含有核酸模板的PCR反應體系分配到上萬個反應器中進行PCR擴增，根據熒光信號的有或無，進行結果計數，通過泊松分布的統計處理，直接得出核酸的拷貝數。相比于實時熒光定量PCR（Quantitative PCR,qPCR），dPCR不需要建立標準曲線，應用前景更廣。本文對dPCR的發展歷史、原理及其應用進行了綜述。
關鍵詞：數字PCR;絕對定量；拷貝數；實時熒光定量PCR.
自1985年Kary Mullis發明PCR技術以來，PCR技術一直是生物醫學領域中重要的實驗方法。隨著分子生物學技術的發展，目前核酸定量的主要方法 是 實 時 熒 光 定 量PCR（Quantitative PCR,qPCR）。數字PCR（Digital PCR,dPCR）是近年來發展起來的新技術，是對傳統PCR方法的技術革新，兩者最主要的區別在于計算核酸拷貝數方法不同，dPCR方法采用了新的定量策略和實驗思路，可以對核酸的拷貝數進行絕對定量，相比于qPCR不需要建立標準曲線，具有更廣闊的應用前景。目前，已有很多基于微滴或芯片的商業化dPCR平臺應用于分子生物學、醫學等各個領域，并發揮了重要作用。因此，本文主要從dPCR方法的發展歷史、原理及其應用方面進行了闡述。
1 dPCR的發展歷史。
1992年，Sykes等[1]從非淋巴細胞和正常體細胞背景中鑒定突變的白血病細胞，檢測了復雜背景下低豐度的IgH重鏈突變基因。該研究中提出了三個重要的原則：有限稀釋、終點信號的有或無及對數據泊松分布的統計處理，為以后dPCR的發展奠定了基礎。
1997年，有研究利用玻璃毛細管作為載體進行PCR反應，可以對模板分子進行定量，驗證了Taq-Man探針可以檢測模板單分子，尤其在微小的反應體系中，發展了單分子定量技術[2],為dPCR單模板擴增提供了技術支持。
1999年，Bert Vogelstein和Kenneth W.Kin-zler[3]正式提出了dPCR的概念，可以將指數型函數轉化成線性函數，對模板進行有限稀釋，根據熒光信號的有或無進行精確定量。實驗利用384孔板對樣品進行稀釋、擴增，來檢測結、直腸癌糞便樣品中c-Ki-Ras基因突變，對數據進行泊松分布的處理。研究還提出了數字PCR的另外一個優勢，由于糞便樣本中含有大量的PCR反應抑制劑，通過對樣品進行稀釋，提高了對反應抑制劑的耐受程度。
2003年，Devin等[4]提出了BEAMing技術，包括小珠（Bead）、乳濁液（Emulsion）、擴增（Amplifi-cation）、磁性（Magnetic）。利用包被鏈霉親和素的磁性珠子和生物素標記的寡核苷酸，形成微乳液，進行PCR擴增，通過流式細胞儀檢測熒光標記來進行計數，這個技術為以后微滴式dPCR的產生提供了技術依據。
2006年，Fluidigm公司第一個生產商業化的基于芯片的dPCR儀，主要包括EP1系統和BioMarkHD系統。2009年，Life Technologies推出了OpenArray和QuantStudio 12K Flex dPCR系統，2013年，Life Technologies又 推 出 了QuantStudio 3DdPCR系統，采用高密度的納升流控芯片技術，將樣本均勻的分配至20 000個單獨的反應孔中。
2011年，Bio-Rad公 司 推 出 了 基 于 微 滴 的QX100dPCR儀，利用油包水技術，將樣品平均分配到20 000個微滴油包水中，利用微滴分析儀對微滴進行分析；2013年，Bio-Rad公司推出在QX100基礎上的升級QX200dPCR儀。2012年RainDance公司推出了RainDrop dPCR儀，在高壓氣體驅動下，將每個標準反應體系分割成包含100萬至1 000萬個皮升級別微滴的反應乳液，提高了dPCR儀的檢測范圍，適于檢測濃度差異較大的樣品（表1）。到目前為止，dPCR的擴增載體從多孔板、毛細管發展到目前的芯片和微滴，降低了反應成本，提高了PCR反應的分液數目和實驗的靈敏度。
2 dPCR的原理。
dPCR的原理是將含有核酸模板的標準PCR反應體系，平均分配成上萬個和數百萬個PCR反應，分配到芯片或微滴中，使每個反應中盡可能含有一個模板分子，進行單分子模板PCR反應，通過讀取熒光信號的有或無進行計數，經過統計學泊松分布的校準進行絕對定量。
關鍵詞：數字PCR;絕對定量；拷貝數；實時熒光定量PCR.
自1985年Kary Mullis發明PCR技術以來，PCR技術一直是生物醫學領域中重要的實驗方法。隨著分子生物學技術的發展，目前核酸定量的主要方法 是 實 時 熒 光 定 量PCR（Quantitative PCR,qPCR）。數字PCR（Digital PCR,dPCR）是近年來發展起來的新技術，是對傳統PCR方法的技術革新，兩者最主要的區別在于計算核酸拷貝數方法不同，dPCR方法采用了新的定量策略和實驗思路，可以對核酸的拷貝數進行絕對定量，相比于qPCR不需要建立標準曲線，具有更廣闊的應用前景。目前，已有很多基于微滴或芯片的商業化dPCR平臺應用于分子生物學、醫學等各個領域，并發揮了重要作用。因此，本文主要從dPCR方法的發展歷史、原理及其應用方面進行了闡述。
1 dPCR的發展歷史。
1992年，Sykes等[1]從非淋巴細胞和正常體細胞背景中鑒定突變的白血病細胞，檢測了復雜背景下低豐度的IgH重鏈突變基因。該研究中提出了三個重要的原則：有限稀釋、終點信號的有或無及對數據泊松分布的統計處理，為以后dPCR的發展奠定了基礎。
1997年，有研究利用玻璃毛細管作為載體進行PCR反應，可以對模板分子進行定量，驗證了Taq-Man探針可以檢測模板單分子，尤其在微小的反應體系中，發展了單分子定量技術[2],為dPCR單模板擴增提供了技術支持。
1999年，Bert Vogelstein和Kenneth W.Kin-zler[3]正式提出了dPCR的概念，可以將指數型函數轉化成線性函數，對模板進行有限稀釋，根據熒光信號的有或無進行精確定量。實驗利用384孔板對樣品進行稀釋、擴增，來檢測結、直腸癌糞便樣品中c-Ki-Ras基因突變，對數據進行泊松分布的處理。研究還提出了數字PCR的另外一個優勢，由于糞便樣本中含有大量的PCR反應抑制劑，通過對樣品進行稀釋，提高了對反應抑制劑的耐受程度。
2003年，Devin等[4]提出了BEAMing技術，包括小珠（Bead）、乳濁液（Emulsion）、擴增（Amplifi-cation）、磁性（Magnetic）。利用包被鏈霉親和素的磁性珠子和生物素標記的寡核苷酸，形成微乳液，進行PCR擴增，通過流式細胞儀檢測熒光標記來進行計數，這個技術為以后微滴式dPCR的產生提供了技術依據。
2006年，Fluidigm公司第一個生產商業化的基于芯片的dPCR儀，主要包括EP1系統和BioMarkHD系統。2009年，Life Technologies推出了OpenArray和QuantStudio 12K Flex dPCR系統，2013年，Life Technologies又 推 出 了QuantStudio 3DdPCR系統，采用高密度的納升流控芯片技術，將樣本均勻的分配至20 000個單獨的反應孔中。
2011年，Bio-Rad公 司 推 出 了 基 于 微 滴 的QX100dPCR儀，利用油包水技術，將樣品平均分配到20 000個微滴油包水中，利用微滴分析儀對微滴進行分析；2013年，Bio-Rad公司推出在QX100基礎上的升級QX200dPCR儀。2012年RainDance公司推出了RainDrop dPCR儀，在高壓氣體驅動下，將每個標準反應體系分割成包含100萬至1 000萬個皮升級別微滴的反應乳液，提高了dPCR儀的檢測范圍，適于檢測濃度差異較大的樣品（表1）。到目前為止，dPCR的擴增載體從多孔板、毛細管發展到目前的芯片和微滴，降低了反應成本，提高了PCR反應的分液數目和實驗的靈敏度。
2 dPCR的原理。
dPCR的原理是將含有核酸模板的標準PCR反應體系，平均分配成上萬個和數百萬個PCR反應，分配到芯片或微滴中，使每個反應中盡可能含有一個模板分子，進行單分子模板PCR反應，通過讀取熒光信號的有或無進行計數，經過統計學泊松分布的校準進行絕對定量。
