摘要：目的研究Rab29在細胞內的分布以及對甲狀旁腺激素受體（PTHR）胞內轉運的調控作用。方法采用免疫熒光技術觀察Rab29在細胞內的分布；細胞內分別轉染野生型Rab29和Rab29兩種突變型，免疫熒光技術觀察3種Rab29在細胞內的分布；細胞內共轉染PTHR和Rab29,免疫熒光技術處理后，在電鏡下觀察Rab29調控PTHR的胞內分布；半衰期實驗檢測細胞Rab29基因敲減后PTHR的穩定性。結果Rab29定位于反式高爾基體，Rab29突變型的細胞內定位均由野生型的核周聚集變為細胞內彌散狀，Rab29的缺陷導致了PTHR的逆膜轉運受損和穩定性下降。結論定位于反式高爾基體的Rab29是逆膜轉運通路中不可或缺的一部分，對PTHR的胞內轉運起著重要的調控作用。
關鍵詞：Rab29;甲狀旁腺激素受體；胞內轉運；調控。
Abstract:Objective To explore the intracellular distribution of the Rab29as well as the regulation of the Rab29in the intracel-lular trafficking of parathyroid hormone receptor（PTHR）。Methods By immunofluorescence technique,the intracellular distribu-tion of the Rab29was observed.Wild type Rab29and two mutant-types of Rab29were transfected respectively and the intracellulardistributions of the three types of Rab29were observed using immunofluorescence technique.Co-transfection of PTHR and Rab29was constructed in cells,and then the intracellular distribution of the PTHR which was regulated by Rab29with the help of electronmicroscope after immunofluorescence treatment had been observed.Using half-life experiment,the stability of the PTHR was testedafter Rab29was knocked-down.Results Rab29located in trans-Golgi apparatus,and the wild-type Rab29exhibited perinuclear pat-tern while the mutant-types were dispersed in cells,the defection of Rab29leaded to the damage of PTHR′s retrograde traffickingas well as its stability.Conclusion Rab29which locates in trans-Golgi is indispensable to retrograde trafficking,and it plays a vitalrole in PTHR′s intracellular trafficking.
Key words:Rab29;parathyroid hormone receptor;intracellular trafficking;regulation.
甲狀旁腺激素受體（PTHR）參與機體骨與鈣代謝，在骨質疏松的發生發展中起著重要的作用[1-3].PTHR的胞內轉運機制是目前研究的熱點[4].Rab29是一種小G蛋白酶，是70多個Rab蛋白家族的一員，已經被證實在囊泡出芽、融合以及保持包膜細胞器的完整性中發揮重要作用[5-7].本研究通過觀察Rab29在細胞內的定位，細胞轉入Rab29突變型觀察PTHR在細胞內的分布以及基因敲除Rab29觀察PTHR的穩定性，從而探討Rab29對甲狀旁腺激素受體胞內轉運的調控作用。
1材料與方法。
1.1材料來源。
人Rab29、PTHRcDNA序列由Open Biosys-tems（GE Dharmacon,美國）公司提供；Myc-6磷酸甘露糖受體（MPR）的質粒由Nebraska大學的Richard G.MacDonald教授贈與；pcDNA3.1-3Flag和pcDNA3.1-3HA空載體由本實驗室提供；10%胎牛血清由Hyclone（美國）公司提供；Hek293和Hela細胞由中國典型培養物保藏中心（CCTCC）提供；脂質體Lipofectamine2000由Invitrogen（美國）提供；電化學發光（ECL）試劑由Sigma（美國）提供。
1.2方法。
1.2.1細胞培養與轉染 用10%胎牛血清完全培養基，在37℃，5% CO2的培養箱中培養Hek293和Hela細胞。常規PCR突變技術獲得Rab29-T21N和Rab29-Q67L突 變，將Rab29的編碼區插入pcDNA3.1-3Flag和pcDNA3.1-3HA空載體 中 的KpnⅠ/Xbal區，以獲得3xFlag/3xHA-Rab29,將PTHR的編碼區插入pcDNA3.1-3Flag和pcDNA3.1-3HA空載中的HindⅢ/Xbal區以獲得3xFlag/3xHA-PTHR.轉染依照轉染試劑說明書將受體質粒與Lipofectamine2000（Invitro-gen,美國）混合，在細胞融合度達到70%~80%時進行。
1.2.2免疫熒光染色成像技術檢測 Rab29在細胞內的定位 將HEK293細胞事先種于鋪好L-多聚賴氨酸和基質膠的蓋玻片上，分別用Golgin97抗體識別高爾基體，EEA1抗體識別內體，Flag抗體識別3Flag-Rab29,在LSM 510共聚焦顯微鏡（Zeiss,德 國）下進行免疫熒光測定。用蛋白轉 運 抑 制 劑（Brefeldin A）處理轉染過3Flag-Rab29的Hela細胞5min,在高爾基體完全碎裂后，使用免疫熒光技術，用Flag抗體識別3Flag-Rab29,TGN46抗體識別反式高爾基體，GM130抗體識別順式高爾基體。
1.2.3免疫熒光染色成像技術檢測 Rab29調控逆膜轉運通路 研究已經證實MPR是最為經典也是最早發現的逆膜轉運中的貨物[8].MPR位于高爾基體，負責識別并轉運新生成的溶解酶至溶酶體，完成轉運后，MPR再經由逆膜轉運通路回到高爾基體進行下一輪識別轉運[9].在表達Myc-MPR的Hela細胞內分別轉染野生型3Flag-Rab29和Rab29的2種突變3Flag-Rab29T21N、3Flag-Rab29Q67L.用免疫熒光技術標記MPR與3種Rab29,在LSM 510共聚焦顯微鏡下進行免疫熒光測定，觀察MPR的細胞內定位。
1.2.4半衰期測定檢測 Rab29在PTHR胞內轉運的作用 設計蛋白質半衰期試驗，在Hek293細胞內轉入3HA-PTHR、Rab29siRNA或 者3HA-PTHR、scramble Rab29 siRNA.Rab29siRNA用于敲除Rab29,scramble Rab29siRNA作為陰性對照。在細胞 培養基內孵育放線菌酮 （CHX）和100nMPTH（1-34），分別在0、2、4、6h時收集細胞裂解液，之后采用Western blot技術檢測每個時間點的PTHR蛋白水平。
2結果。
2.1 Rab29定位于反式高爾基體 共聚焦顯微鏡下觀察3Flag-Rab29在Hela細胞內成核周聚集分布，并且與高爾基體的標志Golgin97有大量共定位，而與內體的標志EEA1共定位較少，這表明Rab29定位于高爾基體。用Flag抗體識別3Flag-Rab29,TGN46抗體識別反式高爾基體，GM130抗體識別順式高爾基體。3Flag-Rab29與反式高爾基體開始共同位于細胞核周，并且 有大量共定位，隨著高爾基體的整體碎裂，3Flag-Rab29仍然與散在細胞質中的反式高爾基體有大量共定位；反之，3Flag-Rab29與順式高爾基體開始共同位于細胞核周，并且有大量共定位，隨著高爾基體的整體碎裂，3Flag-Rab29幾乎不與順式高爾基體共定位。
關鍵詞：Rab29;甲狀旁腺激素受體；胞內轉運；調控。
Abstract:Objective To explore the intracellular distribution of the Rab29as well as the regulation of the Rab29in the intracel-lular trafficking of parathyroid hormone receptor（PTHR）。Methods By immunofluorescence technique,the intracellular distribu-tion of the Rab29was observed.Wild type Rab29and two mutant-types of Rab29were transfected respectively and the intracellulardistributions of the three types of Rab29were observed using immunofluorescence technique.Co-transfection of PTHR and Rab29was constructed in cells,and then the intracellular distribution of the PTHR which was regulated by Rab29with the help of electronmicroscope after immunofluorescence treatment had been observed.Using half-life experiment,the stability of the PTHR was testedafter Rab29was knocked-down.Results Rab29located in trans-Golgi apparatus,and the wild-type Rab29exhibited perinuclear pat-tern while the mutant-types were dispersed in cells,the defection of Rab29leaded to the damage of PTHR′s retrograde traffickingas well as its stability.Conclusion Rab29which locates in trans-Golgi is indispensable to retrograde trafficking,and it plays a vitalrole in PTHR′s intracellular trafficking.
Key words:Rab29;parathyroid hormone receptor;intracellular trafficking;regulation.
甲狀旁腺激素受體（PTHR）參與機體骨與鈣代謝，在骨質疏松的發生發展中起著重要的作用[1-3].PTHR的胞內轉運機制是目前研究的熱點[4].Rab29是一種小G蛋白酶，是70多個Rab蛋白家族的一員，已經被證實在囊泡出芽、融合以及保持包膜細胞器的完整性中發揮重要作用[5-7].本研究通過觀察Rab29在細胞內的定位，細胞轉入Rab29突變型觀察PTHR在細胞內的分布以及基因敲除Rab29觀察PTHR的穩定性，從而探討Rab29對甲狀旁腺激素受體胞內轉運的調控作用。
1材料與方法。
1.1材料來源。
人Rab29、PTHRcDNA序列由Open Biosys-tems（GE Dharmacon,美國）公司提供；Myc-6磷酸甘露糖受體（MPR）的質粒由Nebraska大學的Richard G.MacDonald教授贈與；pcDNA3.1-3Flag和pcDNA3.1-3HA空載體由本實驗室提供；10%胎牛血清由Hyclone（美國）公司提供；Hek293和Hela細胞由中國典型培養物保藏中心（CCTCC）提供；脂質體Lipofectamine2000由Invitrogen（美國）提供；電化學發光（ECL）試劑由Sigma（美國）提供。
1.2方法。
1.2.1細胞培養與轉染 用10%胎牛血清完全培養基，在37℃，5% CO2的培養箱中培養Hek293和Hela細胞。常規PCR突變技術獲得Rab29-T21N和Rab29-Q67L突 變，將Rab29的編碼區插入pcDNA3.1-3Flag和pcDNA3.1-3HA空載體 中 的KpnⅠ/Xbal區，以獲得3xFlag/3xHA-Rab29,將PTHR的編碼區插入pcDNA3.1-3Flag和pcDNA3.1-3HA空載中的HindⅢ/Xbal區以獲得3xFlag/3xHA-PTHR.轉染依照轉染試劑說明書將受體質粒與Lipofectamine2000（Invitro-gen,美國）混合，在細胞融合度達到70%~80%時進行。
1.2.2免疫熒光染色成像技術檢測 Rab29在細胞內的定位 將HEK293細胞事先種于鋪好L-多聚賴氨酸和基質膠的蓋玻片上，分別用Golgin97抗體識別高爾基體，EEA1抗體識別內體，Flag抗體識別3Flag-Rab29,在LSM 510共聚焦顯微鏡（Zeiss,德 國）下進行免疫熒光測定。用蛋白轉 運 抑 制 劑（Brefeldin A）處理轉染過3Flag-Rab29的Hela細胞5min,在高爾基體完全碎裂后，使用免疫熒光技術，用Flag抗體識別3Flag-Rab29,TGN46抗體識別反式高爾基體，GM130抗體識別順式高爾基體。
1.2.3免疫熒光染色成像技術檢測 Rab29調控逆膜轉運通路 研究已經證實MPR是最為經典也是最早發現的逆膜轉運中的貨物[8].MPR位于高爾基體，負責識別并轉運新生成的溶解酶至溶酶體，完成轉運后，MPR再經由逆膜轉運通路回到高爾基體進行下一輪識別轉運[9].在表達Myc-MPR的Hela細胞內分別轉染野生型3Flag-Rab29和Rab29的2種突變3Flag-Rab29T21N、3Flag-Rab29Q67L.用免疫熒光技術標記MPR與3種Rab29,在LSM 510共聚焦顯微鏡下進行免疫熒光測定，觀察MPR的細胞內定位。
1.2.4半衰期測定檢測 Rab29在PTHR胞內轉運的作用 設計蛋白質半衰期試驗，在Hek293細胞內轉入3HA-PTHR、Rab29siRNA或 者3HA-PTHR、scramble Rab29 siRNA.Rab29siRNA用于敲除Rab29,scramble Rab29siRNA作為陰性對照。在細胞 培養基內孵育放線菌酮 （CHX）和100nMPTH（1-34），分別在0、2、4、6h時收集細胞裂解液，之后采用Western blot技術檢測每個時間點的PTHR蛋白水平。
2結果。
2.1 Rab29定位于反式高爾基體 共聚焦顯微鏡下觀察3Flag-Rab29在Hela細胞內成核周聚集分布，并且與高爾基體的標志Golgin97有大量共定位，而與內體的標志EEA1共定位較少，這表明Rab29定位于高爾基體。用Flag抗體識別3Flag-Rab29,TGN46抗體識別反式高爾基體，GM130抗體識別順式高爾基體。3Flag-Rab29與反式高爾基體開始共同位于細胞核周，并且 有大量共定位，隨著高爾基體的整體碎裂，3Flag-Rab29仍然與散在細胞質中的反式高爾基體有大量共定位；反之，3Flag-Rab29與順式高爾基體開始共同位于細胞核周，并且有大量共定位，隨著高爾基體的整體碎裂，3Flag-Rab29幾乎不與順式高爾基體共定位。
