RNA 干擾（RNA interference,RNAi）技術作為分子生物學研究中發展迅速的一種新興基因阻斷技術，目前已成為生物領域的研究熱點。它是一種進化上保守的作用機制，廣泛存在于動物、植物和微生物中，包括真菌中的基因壓制（Gene quelling）現象、植物中的共抑制（Co-suppression）現象和動物中的基因干擾現象[1].這些現象的產生主要是通過反義 RNA 與正義 RNA 形成的 dsRNA（Double-stra-nded RNA,dsRNA）分子，在細胞內被切割成 21-23 bp 大小的 siRNA（Small interference RNA），特異性降解與之同源的單個內源靶基因的 mRNA,從而阻斷基因表達，產生基因沉默[2,3].近幾年發展的RNAi 技術能夠高效特異的沉默功能基因，使生物體產生相應的功能缺陷表型，以此確定基因的功能。

隨著多種真菌如構巢曲霉（Aspergillus nidulans）、粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）、大麗輪枝菌（Vertic-illium dahliae）和稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）等基因組測序計劃的完成，真菌基因功能的鑒定迫在眉睫[4].RNAi 技術以其特異、高效、廣泛性優勢，被迅速應用到真菌基因功能的研究領域中，逐漸成為一種具有潛力的基因功能研究技術。

1 RNAi的發現

20 世紀 90 年代初，Jorgensen 研究組將一個強啟動子控制的色素合成相關基因--查耳酮合成酶基因（chs）轉入牽?；ㄖ?，試圖用轉基因技術手段使紫色矮牽?；ǖ幕ǘ涓悠G麗，結果并未獲得預期的深紫色花朵，反而得到了斑駁狀花朵及白色的花。深入的研究證明，被轉入該植物中的chs基因與牽?；ㄖ信c該基因同源的色素基因的表達均受到了抑制，這種外源基因和自身同源基因均受到抑制的現象被命名為共抑制（co-suppression）現象[5,6].

該現象同樣出現于真菌轉基因研究中。1994年，當 Cogoni 等[7]把外源同源基因轉入脈孢菌（Neurospora）時，該基因及Neurospora自身的同源基因的表達均顯著性的下降，當時把這種在真菌中發現的類似于共抑制的現象稱為"基因壓制"（Genequelling）現象，但當時并未明確其機制。

1995 年，美國康乃爾大學的 Guo 和 Kemphues博士等[8]發現由正義 RNA 和反義 RNA 形成的dsRNA 均能有效并特異性地抑制秀麗新小桿線蟲（Caenorhabditis elegans）中par-l基因的表達。這一發現有力地沖擊了只有反義 RNA 形成的 dsRNA 才能有效地干擾具有同源序列的內源基因的表達這一傳統觀念。然而由于當時理論水平和實驗依據的限制，這一現象并沒有得到合理的解釋。

1996 年，Cogoni 等[9]經過深入的研究證實真菌中的 gene quelling 與植物中的基因沉默機理基本相同。

1998 年，華盛頓卡耐基研究院的科學家 Fire[10]和麻省大學醫學院的科學家 Mello 首次證實了 Guo等發現的由正義 RNA 抑制同源基因表達的現象是由于在體外轉錄制備的 RNA 中污染了 dsRNA 而引發，并將這種現象命名為 RNA 干擾（RNAi）。由于RNAi 的作用，功能基因無法表達而使其相對應的表型不能顯現，導致基因功能的缺失或減弱，因此又將此作用機制稱之為基因沉默（Gene silencing）。

Fire 和 Mello 的研究首次證明 RNAi 作用存在于生物界中，并因此獲得 2006 年諾貝爾生理學和醫學獎[11].

目前研究發現，很早以前 RNAi 就普遍存在于小鼠、斑馬魚、果蠅、擬南芥和真菌等生物之中。在整個生物界進化過程中，它既是一種古老的生物學現象，又是一種保守的自我保護機制，因此又被稱為"基因組的免疫系統".這種免疫機制的存在不僅能避免生物體的基因組受到諸如病毒基因的外源基因分子的干擾和襲擊，而且，也能通過實時定量地調控各階段基因的表達來控制和調節細胞分化[12,13].

2 RNAi的分子機制

RNAi 一經發現便引起了研究者們的高度重視，如今已成為一種高效的"基因沉默"技術，并在此技術基礎之上衍生出了 TALAN 技術和 CRISPR 技術。該技術廣泛應用于生物的基因功能鑒定和功能基因表達調控領域的研究，并且對 dsRNA 介導的基因沉默的分子機制的研究一直是生物學研究的熱點。

經研究證明，RNAi 的分子作用機制在包括動植物的高等真核生物細胞中與真菌細胞中不盡相同。在動植物細胞中，依據 dsRNA 分子的來源，存在兩種不同但又相關的 RNAi 途徑 :siRNA 途徑和 miRNA（microRNA）途徑。siRNA 是由外源 RNA 或外源載體等導入細胞后產生的一系列小 RNA,它能與靶mRNA 完全互補并使其降解[14,15];miRNA 是一類由含頸環結構的前體 RNA 經過 Dicer 酶酶切而形成的非編碼小 RNA,它與靶 mRNA 的 3'- 非編碼區結合，抑制靶 mRNA 降解和翻譯表達，從而導致特定基因的沉默，而且大多數 miRNA 參與了生長與發育，生理代謝或壓力應激過程[4,16,17].在真菌細胞中，gene quelling 屬于進化上保守的 siRNA 途徑，即典型的 RNAi 途徑，而 miRNA 途徑尚未被發現[1,18].

另外，在粗糙脈胞菌中發現了第二種真菌基因沉默現象即減數分裂沉默（Meiotic silencing by unpairedDNA,MSUD），在第一次減數分裂前期，一段 DNA在親本一方正常，另一方不存在，或在親本雙方不同從而產生了未配對的 DNA,使同源染色體不能正常配對，導致減數分裂異常，未配對的 DNA 就發生了沉默。這種現象發生在染色體配對到子囊孢子形成時期，MSUD 參與了生長發育周期，因此，可能與 miRNA 起源于同一種古老的沉默機制[4,15].典型 RNAi 的分子機制作用途徑大致可分為起始階段、效應階段和擴增階段 3 個階段。

2.1 起始階段

dsRNA 分為分子間雙鏈和分子內雙鏈。分子間雙鏈是由分開的兩個獨立 RNA 分子互補形成，而分子內雙鏈是由一個 RNA 分子回折，自身互補而形成。

當細胞中的 dsRNA 擴增達到一定量時，外源或內源性的 dsRNA 被一種 dsRNA 特異的核酸酶 RnaseIII家族中的 Dicer 酶特異識別，并將其逐步切割成長約21-23 nt 的 dsRNA 片 段（siRNA）。siRNA 是 RNAi作用賴以發生的重要中間效應分子，具有獨特的特征性結構，其兩條單鏈末端分別為 5'-PO3和 3'-OH,該 siRNA 與所作用的靶 mRNA 具有高度的核苷酸序列同源性。此外，由于每條 siRNA 單鏈的 3' 末端均有 2-3 個突出的非配對的堿基殘基（圖 1）[19-21],所以其化學性質相對穩定，無須像反義核苷酸那樣通過大量的化學修飾來提高半衰期，這也是細胞賴以區分真正的 siRNA 和其他小 dsRNA 的結構基礎。

2.2效應階段

siRNA可與細胞質中特定的酶形成RNA誘導的沉默復合物（RNA-induced silencing complex,RISC ）， siRNA、核酸內切酶、核酸外切酶以及解旋酶是該復合體中的必備成分。在RISC的作用下，siRNA解鏈成為單鏈，由其中的反義鏈特異識別目的mRNA并與之結合。一經結合，細胞內的核酸內切酶就在靶mRNA的近中點位置切害」目的mRNA,被切害」的mRNA片段被核酸外切酶降解后無法正常編碼成相應的蛋白質，從而導致功能缺失z3. za.

2.3擴增階段

siRNA的反義鏈與靶mRNA的上游部分序列互補zs.在依賴于RNA的RNA聚合酶（RNA-depen-dent RNA polymerise, RdRP）的作用下，經初級階段產生的，iRNA分子在細胞內能以自身反義鏈為擴增引物，以目標mRNA為模板，復制出新的dsRNA,新合成的 dsRNA 又可被降解成若干 siRNA,這種新產生的 siRNA（ 次 級 siRNA,secondarysiRNA）又可形成更多的 RISC 復合物并作用于mRNA,使 mRNA 降解。這個過程使 RNAi 效應得到放大[26,27].

3 RNAi的特點

3.1 RNAi的高度特異性

siRNA 與靶基因的 mRNA 在序列上嚴格遵循堿基互補配對原則，研究發現，即使發生一個堿基的錯配，目的 mRNA 的沉默效率也會大大降低[28].這種高精確度的序列特異性的識別能使 dsRNA 專一地降解與之同源的 mRNA,從而精確沉默目的基因。

3.2 RNAi的高效性

細胞內的 RNAi 途徑存在級聯放大效應，極少量的 dsRNA 經起始階段--效應階段--擴增階段的循環就能產生強烈的 RNAi 效應。靶 mRNA 被降解之后，細胞內的核糖核酸聚合酶繼續催促 dsRNA的合成并反復利用該 dsRNA 進行基因沉默，以維持高效、特異靶向的干擾作用。RNAi 對基因表達的抑制率可達 90% 以上，這種高效的抑制效率是傳統基因沉默實驗技術所欠缺的[29,30].