RNA 的提取技術是現代分子生物學中最常用的操作技術之一。不同組織中總 RNA 的提取實質上就是將組織細胞裂解，從而釋放 RNA,在進一步的研究中，我們高度依賴所提取的總 RNA 的質量。RNA 樣品易受環境因素特別是 RNase 的影響而降解[2],提取 RNA 的過程中，只要存在少量的RNase 就會引起 RNA 降解。故在實驗中應嚴格控制各個影響因素、防止 RNase 的污染，是提取高質量 RNA 樣品的關鍵。

1 組織質量的影響

組織樣本質量是 RNA 提取實驗成功與否的重要因素之一。我們的實驗是小鼠腫瘤組織總 RNA的提取，基本所有組織和細胞都含有內源性 RNase,為了防止總 RNA 的降解，使用液氮來速凍組織，在研磨組織的過程中，我們使用研缽加液氮研磨法進行研磨[3].即研磨過程中將組織放入研缽后，加入液氮研磨并及時添加液氮，確保腫瘤組織能夠一直浸在液氮中，防止 RNA 降解，保證 RNA 的質量。

2 實驗器具的影響

由于 RNA 本身不穩定，加之 RNase 的普遍存在，使得分離完整的 RNA 分子更為困難[4].在RNA 提取過程中最主要是防止外源性 RNase 的污染，首先是要保證整個實驗在超凈工作臺中完成； 其次是對實驗器具進行處理，主要有以下幾點： （ 1） 研磨過程使用的研缽需要高溫干燥處理后使用； （ 2）實驗中使用的 EP 管，槍頭等塑料制品，需要用DEPC 水[1]浸泡 24h 后，經高溫滅菌干燥后使用；（ 3） 為了防止 RNase 的污染，用 DEPC 水替代三蒸水進行溶液的配制； （ 4） RNA 操作中使用專用的器械，有條件的也可以設置專用實驗室。

3 實驗人員的影響

實驗人員對整個實驗的影響，主要是外源性RNase 的影響。外源性的 RNase 是無處不在的，它很容易污染實驗中的各種器材、實驗用品和實驗試劑等； 實際操作過程中，手套是最容易污染樣品的，因此手套要勤換； 實驗操作人員說話過程中所帶的唾液中也會攜帶 RNase,會導致樣品的降解，故需帶口罩操作； 在 RNA 整個提取過程中，實驗人員熟練快速的完成整個 RNA 的提取，減少實驗所用的時間，也可有效減少外源性 RNase 污染的幾率。

4 實驗試劑的影響

RNA 提取的過程中，每一步所用試劑的量，以及所用的時間都會影響 RNA 的完整性、含量及純度。

4. 1 Trizol 試劑

Trizol 試劑是即用型細胞和組織總 RNA 提取試劑，可直接從組織或細胞中提取總 RNA,能迅速裂解細胞，并抑制細胞釋放出來的核酸酶； 使用 Trizol試劑時，1mL Trizol 最多裂解 100mg 的組織，而在實際實驗中，我們發現 100mg 的組織使用 1. 2mL Tr-izol 裂解，可以獲得更滿意的結果。

4. 2 氯仿

氯仿也叫三氯甲烷，是一種有機物 - 烴的衍生物，在光照下遇空氣會逐漸被氧化并生成劇毒的光氣，因此需要存放在密封的棕色瓶中； 氯仿分離是RNA 提取實驗關鍵步驟之一，勻漿后的組織液中加入氯仿，震蕩離心后，RNA 會溶解在上層的水相中，轉移 RNA 到新管的過程中，采用小槍頭少量多次吸取，可防止誤吸下層雜質[6].

4. 3 異丙醇和乙醇

RNA 和某些雜質不溶于異丙醇，故異丙醇具有沉淀 RNA 的作用，RNA 沉于管底后，用 75% 的乙醇對沉淀進行清洗，乙醇可洗去沉淀中可能的有機物雜質和殘留的異丙醇。但由于醇類可以抑制核酸的反應，因此在棄乙醇后晾干的步驟是至關重要的，在這里不可以用加熱或離心的方式使 RNA 干燥，否則會出現 RNA 樣品很難溶解的現象。

5 RNA 濃度的測定

在 RNA 提取之后，我們使用 DU800 紫外分光光度計測 OD 值來定量 RNA 的濃度。在測定 OD 值時，每一個樣品測定前都需要用 DEPC 水進行儀器校正，測定后用蒸餾水徹底清洗比色杯，從而避免樣品之間交叉污染，影響結果。

6 RNA 的保存

由于 RNase 廣泛存在，提取后的總 RNA 中常常會存在少量的 RNase,隨著保存時間的延長，極易出現 RNA 降解的情況； 實驗中一旦出現大量的 RNA降解，會直接導致后續實驗無法順利進行。cDNA可反映 RNA 的性狀，而且 cDNA 的穩定性較好。因此，提取后的 RNA 經過檢測純度和濃度合格后，應盡快進行后續實驗或取部分 RNA 提取物及時逆轉錄成 cDNA 保存，以保證后續實驗的順利進行。

7 結語

RNA 質量的好壞會直接影響后續實驗，提取高質量 RNA 是后期實驗的前提和基礎。因此，熟練的掌握 RNA 提取的基本原理、注意事項和各種影響因素，對實驗的成功與否至關重要。以上是筆者總結的一些經驗，在實驗過程中遇到具體的問題，還需要根據實際情況進行不斷的改進和完善，從而使實驗能夠順利完成。

參考文獻：

[1]王桂玲，黃東陽，劉戈飛。 一種從動物組織中提取高質量總RNA 的方法[J]. 生命科學研究，2003,7（ 3） : 275-278

[2]Barbas A,Matos RG,Amblar M,et al. New insights into the mech-anism of RNA degradation by ribonuclease II: identification of theresidue responsible for setting the RNase II end product [J] . J BioIChem,2008,283: 13070-13076

[3]張宏山，許明，張陽，等。 小鼠心肌組織 3 種總 RNA 提取方法比較[J]. 臨床心血管病雜志，2010,（ 2） : 149-150

[4]（ 美） R. E. 法雷爾。 RNA 分離與鑒定實驗指南： RNA 研究方法（ 原著第 3 版） . 北京： 化學工業出版社，2008,26-27

[5]王長曄。 RNA 提取過程中 DEPC 的毒性[J]. 創新技術，2008,（ 5） : 5-6

[6]戴先成，柴智鋒，徐永城，等。 Trizol 法大鼠心肌總 RNA 提取方法探討[J]. 刑事技術，2014,（ 3） : 15-16