在過去的幾十年里，基因組測序已經深入到了幾乎生命科學[1]的每個領域，包括人類基因組計劃，生物醫學科學領域中的細菌病原體和水稻基因組分析[2]等等。新一代測序的特點如下：
Helicos/HeliScope HeliScope單分子測序是第一個利用直接RNA和DNA測量的進行的基因分析?；蚪MDNA序列隨機地被分成小塊然后用Poly-A擴增3‘末端。在末端轉移酶存在條件下，將Cy5熒光團添加至3’末端。小片段被捕獲在表面，這些捕獲的鏈充當合成定序過程的模板：添加聚合酶和一種熒光標記的核苷酸 （C、G、A 或T）。（1）聚合酶促進了所有模板中熒光的核苷酸與初期的互補鏈的序列特異性合并；（2）洗脫之后，移除了所有自由核苷酸，合并的核苷酸成像并記錄位置；（3）熒光組在高效率的分裂過程中移除，剩下了合并的核苷酸；（4）同樣的過程在其他三種堿基中也進行；（5）多樣的四堿基循環導致了互補鏈在長度上長于數以億計的模板中的25中堿基，每個循環都包括25個獨立通道的兩個流動插槽，同時96孔板能用于測序。這樣，4800個樣本能在同一循環中測序。
PacBio PacBio RS是一種單分子實時測序系統。為了得到高準確度的多樣檢測，SMRTbell 作為準備測序的方法?；蚪M測序來講，DNA被隨機分裂然后末端修復，繼而3‘腺嘌呤被添加到碎片的基因組DNA,促進了接頭和T環的連接。單個的DNA核苷酸，形成了一個分子內的啞鈴結構，被用作接頭。SMRTbell DNA模板在結構上是線性分子但是其套馬環接頭創造了拓撲的圓形分子。
SMRT形成了零模式波形數列[3].當序列反應開始時，引物與模板的單鏈環部位退火后，這個雙鏈部位就可以結合到已固定在ZWM底部的聚合酶上。將DNA聚合酶和不同熒光標記的dNTP放入ZMW孔的底部，進行合成反應。每個熒光圖案對應增長的DNA鏈中一個特殊的堿基。在堿基合成的起始階段，熒光核苷酸被帶至聚合酶的活性部位然后結合到ZMW底部。在ZMW底部，高分辨率相機記錄了被合并的核苷酸熒光。
其他二代測序標記都在5’甲基上，在合成過程中熒光標記物留在DNA鏈上，隨DNA鏈的延伸會產生三維空間阻力導致DNA鏈延長到一定程度后會出現錯讀。這是NGS的測序讀長僅能達到100多bp到200bp的一個原因。
合成過程中，每次進入一個堿基，原始數據會實時地產生一個脈沖峰，每兩個相鄰的脈沖峰之間有一定的距離，這個距離的長短與模板上堿基是否存在修飾有關。如果有堿基修飾會導致兩個相鄰峰之間距離加大。根據這個距離的變化，可以實時判斷模板相應位點是否出現堿基修飾。其局限性在于每個ZWM底部固定化的DNA聚合美的隨機性，優點在于讀取長度長，測序時間短。
全基因組 全基因組平臺代表第一個作為公共服務的高通量測序平臺，測序能力強。全基因組服務依賴于環狀DNA文庫的準備和滾環擴增過程產生在固體支持物上的DNA納米球。
基因組DNA經超聲處理打斷，收集400-500bp的片段。片段尾端酶促修復，去磷酸化。普通的接頭使用切口平移連接到DNA片段上。在夾板寡核苷酸存在條件下，進行產物消化，甲基化，線性化，接頭連接，PCR擴增，限制性內切酶酶解，重復環化過程直至四個獨特的已知接頭合并進入環化序列文庫分子。在最終的環化步驟之前，單鏈模板用磁珠捕獲和核酸外切酶處理的方法鏈分離純化。帶著長線性產物的回文序列促進了分子內部螺旋和DNA納米球的形成。在兩端加接頭，模板環化、酶切，最后產生大約 400 個堿基的測序片段。六甲基二硅氮烷覆蓋的CGA平臺流體室表面使用光刻法用氨基硅烷打點。然而，HDMS抑制DNA結合，帶正電荷的氨基硅烷與帶負電荷的DNBs結合。
全基因組的CGA平臺使用了探針錨定序列連接方法即cPAL測序策略。在探針的第一個位置，4個退化的9-mer寡核苷酸通過與一個特殊的核苷酸（A、C、G或T）對應的特定熒光團標記。序列測定發生在正確配對探針與模板雜交，在T4 DNA連接酶作用下與錨鏈接的反應中。在連接產物成像后，連接的錨-探針分子變性。雜交、連接、成像和變性的過程使用包含有已知在n+1、n+2、n+3和 n+4位點處熒光標記的探針重復五次。
進行一個雜交和連接循環就要對帶有DNA納米球的芯片進行熒光成像，然后用甲酰胺溶液對DNA納米球進行重建。這種循環被重復直到全部組合的探針和錨定序列被檢測。這種方式減少了試劑消耗并去除了潛在的累積錯誤。
參考文獻
[1]Pallen, M.J., Nelson, K. & Preston, G.M. 2007. BacterialPathogenomics （ASM Press）。
[2]Yu, J., Hu, S., Wang, J. et al. 2002, A draft sequence of therice genome （ Oryza sativa L.ssp.Indica）， Science, 295, 79-92.
[3]Thomas P.N., Denitsa M., Matthew B.K.et al.2011. Land-scape of Next -Generation Sequencing Technologies. Anal.Chem. 83, 4327-4341.
