微生物能夠產生多種具有生物活性的次級代謝產物，其中大部分活性次級代謝產物來源于放線菌[1],這些物質具有抗菌、抗腫瘤、殺蟲、免疫抑制和免疫激活等功效，被廣泛地應用于醫藥業、農業、獸業、食品工業等領域。近年來，隨著抗生素耐藥菌的不斷出現，深入研究放線菌的次級代謝調控過程，提高放線菌抗生素的生物合成，發現和生產新抗生素變得越來越迫切。
代謝調控是通過重組 DNA 技術或其他技術，有目的地改變生物體中已有的代謝網絡和表達調控網絡，改善細胞的性能，并用于化學轉化、能量轉移及大分子裝配的過程。本文總結了通過代謝調控來提高放線菌抗生素生物合成的不同方法（ 圖1） ,主要包括調節調控基因表達，增加基因簇拷貝數及基因簇的異源表達，過表達抗性基因和轉運基因，提高前體代謝通量和核糖體工程。
1 調節調控基因的表達
抗生素的生物合成基因一般成簇存在，除了含有結構基因之外，通常還包含調控基因以及抗生素的抗性基因和轉運基因?？剐曰?、調控基因和轉運基因組成了一種協同機制，共同調控抗生素的生物合成。
調控因子是一類在基因表達調控中，能直接或間接地識別或結合在各順式作用元件序列上，參與調控靶基因轉錄效率的蛋白質?？股厣锖铣苫虼氐霓D錄起始普遍依賴全局或途徑特異調控蛋白的調控。全局調控因子不僅調控多種抗生素的產生，還參與放線菌的形態學分化，其調控的方式較為復雜和廣泛。而途徑特異性調控因子主要參與特定的抗生素的生物合成過程，與全局調控因子相比，其調節的方式更為直接。有些調控因子既可以作為全局調控因子，也可以對抗生素的生物合成進行途徑特異性調控。例如 TetR 家族轉錄調節因子 （ TetR family transcriptional regulator,TFR） .
TFRs 是一類常見的原核轉錄調控蛋白家族，參與調控多種代謝和生理過程，如抗生素的生物合成、三羧酸循環和生物膜的形成。TFRs 通常以同源二聚體的形式存在，每一個單體包括一個相對保守的N 端 DNA 結合（ DNB） 區域，一個 C 端配體結合和聚合作用（ LBD） 區域。通常 DNB 區域具有保守的螺旋-轉角-螺旋的特征性結構，而 LBD 區域則根據結合配體的不同而表現出序列和結構的多樣性。
TFRs 的 C 端區域介導自身形成同源二聚體，二聚體化的 TFRs 的 N 端 DNB 結構域與被調控基因的上游啟動子區域結合，使 RNA 聚合酶-啟動子轉錄復合物不能轉變成有效的轉錄狀態，從而阻止下游受調控基因的轉錄起始[3].但是當 TFRs 與小分子配體結合后，會使構象發生改變并從 DNA 上解離，從而啟動下游基因的轉錄[4].
1. 1 途徑特異性調控因子
途徑特異性調控基因一般存在于次級代謝產物的生物合成基因簇內，主要包括鏈霉菌抗生素調控蛋白（ SARP） 家族。途徑特異性調控因子的作用分為正向調節和負向調節，通過途徑特異性正調控基因的過表達，負調控基因的敲除可以提高抗生素的生物合成。近年來，途徑特異性調控因子應用于提高放線菌抗生素的生物合成取得了較多的進展（ 表 1） .
Zhu 等[5]從深海放線菌（ Marinactinospora ther-motolerans SCSIO 00652） 中發現了一種核苷類抗生素 A201A,利用全基因組掃描（ whole-genome scan-ning） 技術，對基因組片段化后建立的基因組文庫進行測序，識別并確證了其生物合成基因簇，并通過序列比對分別推測了基因簇中不同基因的功能，查找并驗證了一個負向調控基因 mtdA.HPLC 分析基因敲除菌株的發酵提取物，發現抗生 素A201A 的產量提高了近 25 倍。
Zhang 等[6]發現 PapR6 是普那霉素（ pristina-mycin II） 生物合成的一種途徑特異性激動劑，papR6 基因敲除菌株普那霉素的產量明顯降低，過表達papR6 基因后的菌株普那霉素的合成明顯增加。凝膠阻滯實驗（ electrophoretic mobility shiftassay,EMSAs） 分析表明： PapR6 蛋白與 snaF 基因的上游區域發生特異性結合。snaF 基因是snaFE1E2GHIJK 操縱子的第 1 個基因，負責前體異丁?；o酶 A 和中間體 C11 α，β-不飽和硫酯的生成。轉錄分析結果表明，papR6 基因敲除后的菌株 snaFE1E2GHIJK 操縱子的表達量明顯減少。這些結果證明了 PapR6 調控因子通過直接調控結構基因 snaF 的表達上升，增加前體和中間體的產生，從而提高普那霉素的生物合成。
1. 2 全局調控因子
除了途徑特異性調控因子以外，全局調控因子則是位于抗生素生物合成基因簇之外，可以調控多種次級代謝途徑，并不局限于一種抗生素的生物合成途徑，因此其調控的范圍更加廣泛、模式更加復雜。近年來，全局調控因子應用于提高抗生素生物合成并取得了較多進展（ 表 2） .
Crp 是天藍色鏈霉菌 Streptomyces coelicolor 的一種全局調控因子，與菌體的形態學分化有關。
Gao 等[15]首次證明了 Crp 參與了調控鏈霉菌的次級代謝和抗生素的生物合成。利用染色質免疫共沉淀-芯片（ ChIP-chip） 技術分析 Crp 蛋白的基因結合位點，在 22 個與次級代謝相關的基因簇中，有 8個是與 Crp 蛋白結合的位點。對這些次級代謝基因進行轉錄分析，發現基因的轉錄水平明顯受到了影響，其中有 6 個基因簇與 ChIP-chip 技術分析的Crp 蛋白的結合位點相同。crp 基因敲除后的菌株抗生素 Act、Red 和 CDA 的生物合成明顯下降。這些數據都表明 Crp 蛋白可以通過與抗生素的生物合成基因簇相互作用，從而影響多種次級代謝過程，在天藍色鏈霉菌中作為一種全局正向調控因子，調控多種抗生素的生物合成。
WblA（ sco） 是天藍色鏈霉菌中的一種全局負調控因子，負調控抗生素 Act、Red 和 CDA 的產生[20-21].Rabyk 等[22]在鏈霉菌 Streptomyces gha-naensis 中發現了 wblA（ gh） 基因，敲除該基因后，默諾霉素（ moenomycin） 的產量增加了 2. 3 倍。
Noh 等[23]構建了一個阿霉素（ doxorubicin,DXR）和道諾霉素（ daunorubicin,DNR） 高產菌株的全基因庫，以 wblA（ sco） 作為探針，利用種間 DNA 微矩陣分析（ interspecies DNA microarray analysis） ,發現鏈霉菌 Streptomyces peucetius 中存在 wblA（ spe）與 wblA（ sco） 具有 95% 的氨基酸序列相似度?；?wblA（ spe） 敲除后的菌株，DXR 和 DNR 的產量有將近 70% 的增長。這些結果表明： wblA（ spe）和 wblA（ gh） 、wblA（ sco） 一樣，是一種全局負調控基因，調控多種抗生素的生物合成。wblA 基因廣泛存在于各種鏈霉菌中，負調控各類抗生素的生物合成。
2 調控抗生素生物合成基因簇的表達
2. 1 增加抗生素生物合成基因簇的拷貝數
在抗生素的生物合成基因簇已知的條件下，增加基因簇的拷貝數可以達到直接增加抗生素生物合成的目的，但是由于同樣受到其他調控因素的影響，抗生素的產量提高有限。井岡霉素 A（ validamycin A,VAL-A） 是一種抗真菌類抗生素，用于治療水稻和其他植物的紋枯病。Zhou 等[27]通過在鏈霉菌 Streptomyces hygro-scopicus 5008 中集成 zouA-介導的 DNA 擴增系統，在 VAL-A 基因簇內部擴增了約 3 ~5 個 VAL-A 的生物合成基因簇，工程菌搖瓶培養后，VAL-A 的產量比野生菌株提高了 34%.
Liao 等[28]在尼克霉素的產生菌 Streptomycesansochromogenes 7100 的染色體中插入了 35 kb 的尼克霉素生物合成基因簇，工程菌的尼克霉素產量明顯提高。其中尼克霉素 X 產量達到 880 mg/L,是野生菌株的 4 倍； 尼克霉素 Z 的產量達到180 mg / L,是野生菌株的 1. 8 倍。
達托霉素（ daptomycin） 是鏈霉菌 Stretptomycesroseosporus 產生的一種天然的環脂肽類抗生素，具有廣譜的革蘭陽性菌殺菌活性。Liao 等[29]在鏈霉菌 Stretptomyces roseosporus 中敲除達托霉素的結構基因 dptJ,工程菌的達托霉素的產量降低了 50%,而 dptJ 基因加倍的菌株，達托霉素的產量提高了 110%.
2. 2 調控抗生素生物合成基因簇的異源表達由于從自然界中分離的野生菌株對其性質研究有限，代謝網絡復雜，中間產物復雜、不穩定或者終產物表達量低，限制了其體內抗生素生物合成途徑的研究。構建研究背景清晰的、容易進行基因操作的異源表達的宿主，有利于發掘與研究新抗生素。
較為常用的異源表達宿主有 Streptomyces coelicolor、Streptomyces avermitilis 以及 Streptomyces lividans 等。
多種放線菌基因組測序分析結果表明，目前被發現的放線菌次級代謝產物僅為總量的 10%,甚至更少[30].基因組挖掘（ genome mining） 通過生物信息學技術分析基因組序列中酶和基因簇的保守區，識別次級代謝生物合成基因簇，并通過基因技術改造菌株，使低產菌株變高產，激活沉默的生物合成基因簇?；蚪M挖掘與異源表達結合是激活沉默的生物合成基因簇，發現新抗生素的一種有效的方法（ 圖 2） .
Luo 等[31]應用基因組挖掘技術從鏈霉菌Streptomyces gnseus 中發現了一個沉默的 PTM（ Pol-ycyclic tetramate macrolactam ） 生 物 合 成 基 因 簇SGR810-815,應用 plug-and-play 的合成生物學方法，在基因簇上游加入 6 種不同來源的啟動子，將基因簇重新構建和組裝后，在鏈霉菌 Streptomyceslividans 中異源表達，其中來源于 Cellulomonas flavi-gena 的 rpsLp啟動子使基因簇相比于中等強度的hrdB 啟動子表達量提高了 150 倍。通過 HPLC-MS分析發酵產物，發現了 3 種新的 PTMs 抗生素。
Komatsu 等[32]在鏈霉菌 Streptomyces avermitilis中外源表達了 20 個次級代謝產物的整個基因簇序列，結果發現絕大多數基因得到表達，甚至包括原來沉默的基因，因此異源表達可以作為喚醒沉默基因表達、發現新抗生素的一種手段。
3 調控抗性基因的表達
抗性基因與菌體對抗生素的耐受性有關，當大多數的抗性蛋白都與抗生素結合后，抗生素的量超過宿主菌自身的耐受，抗性蛋白就會抑制相關基因的表達，阻止抗生素生物合成過程的繼續。因此，增加抗性基因的表達，提高菌體對自產抗生素的耐受性，可以提高抗生素的生物合成。
Jin 等[33]通過在鏈霉菌 Streptomyces pristi-naespiralis 中過表達抗性基因 ptr,篩選得到兩株工程菌 SPR1 和 SPR2,普那霉素的產量分別可以達到 0. 11 和 0. 15 g/L,與野生菌 Streptomyces pristi-naespiralis ATCC 25486 相比，抗生素的產量分別提高了 6 ~8 倍。因此增加抗性基因的拷貝數可以提高放線菌對自身產生的抗生素濃度的耐受性，作為提高抗生素生物合成的一種手段。
4 調控轉運基因的表達
當細胞內抗生素的濃度超過了菌體自身的承受能力，就會對菌體的生長代謝產生影響，包括抗生素的生物合成。因此，及時把合成的抗生素泵出胞外，使胞內抗生素濃度維持在適度范圍，才能促使菌體不斷合成抗生素?？股乇贸霭獾倪^程需要轉運蛋白的參與，因此提高轉運蛋白的表達量，可以達到提高抗生素生物合成的目的。
阿維霉素（ avermectins） 是鏈霉菌 Streptomycesavermitilis 產生的一種大環聚酮類殺蟲劑，操縱子avtAB 存在阿維霉素生物合成基因簇的上游，編碼一種 ABC 轉運蛋白。這種蛋白與哺乳動物的多重耐藥泵 Pgp 蛋白有高度的同源性，負責將胞內的阿維霉素泵出胞外。Qiu 等[34]通過在鏈霉菌 Strepto-myces avermitilis 中過表達 avtAB 基因，提高轉運蛋白 AvtAB 的合成量，使多余的阿維霉素被泵出胞外，減少了阿維霉素對其合成基因的反饋抑制，使阿維霉素的產量提高了約 50%.OtrC 是鏈霉菌 Streptomyces rimosus 產生的一種土霉素抗性蛋白，氨基酸序列分析發現 OtrC 可能是一種 ATP-binding cassette（ ABC） 轉運蛋白蛋白，有多重耐藥功能。將 otrC 基因分別在菌株M4018、SR16 中加倍表達，菌株的 OTC 產量分別提高了1. 6 和1. 4 倍； otrC 敲除后的菌株 OTC 產量下降了 20%[35].
5 調控前體的代謝通量
前體是某一代謝中間體的前一階段的物質，因此前體的量將成為抗生素生物合成的瓶頸。利用重組 DNA 技術進行對前體代謝途徑進行遺傳改造，對初級代謝通量進行重新定向，尤其是對前體生物合成的關鍵酶進行操作，增加特定前體的利用率，從而增加抗生素的生物合成。
Zabala 等[36]通過在鏈霉菌 Streptomyces argilla-ceus 中過表達 pgm 基因（ 編碼磷酸葡萄糖變位酶）或敲除 glgCa 基因（ 編碼 ADP-葡萄糖焦磷酸化酶） ,提高了前體 1-磷酸葡萄糖的產量，從而提高了光輝霉素的產量。同時在基因過表達后的菌株發現了 4 種光輝霉素的衍生物，與光輝霉素相比，其抗腫瘤活性更好，毒性更小。
Phenazinomycin 是一種天然產物，具有抗鼠源腫瘤作用，對阿霉素耐藥的白血病細胞 P388 也有效。Qin 等[37]在鏈霉菌 Streptomyces iakyrus DSM41873 中敲除放線菌素 G（ actinomycin G） 基因簇中的 acmG5'基因，阻斷了放線菌素 G 的產生，使前體分支酸的利用減少，從而增加了 phenazinomycin 的合成。
Ren 等[38]通過敲除梧寧霉素基因簇中編碼Ⅰ型聚酮合酶（ PKS） 的基因 ttmS1,抑制了輔酶 A 合成梧寧霉素的過程，使其更多地合成制霉菌素，從而使制霉菌素的產量提高了 10 倍以上。因此敲除前體代謝的分支途徑，對前體的代謝通量進行重新分配，可以提高另一種目標抗生素的產量。
6 調控核糖體相關蛋白的表達
目前抗生素的生物合成途徑主要有 PKS、NRPS、RiPPs 等，其中 RiPPs 途徑合成的抗生素需要在核糖體中完成，因此與核糖體功能相關的蛋白也影響到其抗生素的生物合成。
核糖體再循環因子（ ribosome recycling factor,RRF） 是一種負責在翻譯終止時將核糖體與 RNA解離的蛋白，在鏈霉菌 Streptomyces diastatochromo-genes 1628 中過表達基因 frr,增加了抗生素豐加霉素的生物合成[39].RimP-SC 是一種核糖體組裝蛋白，在鏈霉菌 Streptomyces coelicolor 中敲除 rimP-SC基因，增加了抗生素 Act、CDA 的生物合成； 敲除鏈霉菌 Streptomyces venezuelae 中的 rimP-SV,同樣明顯提高了抗生素 jadomycin 的產量[40].
7 結 語
放線菌基因組中存在大量沉默的次級代謝產物生物合成基因簇，這些基因簇在試驗條件下未表達或者表達量低，放線菌中還存在大量有價值的次級代謝產物，可以作為藥物開發的重要來源。隨著生物信息學的發展，利用基因組挖掘技術來探測和識別次級代謝生物合成基因簇，通過重組 DNA 技術對基因簇進行改造和組裝，異源表達激活沉默的基因簇及發現新抗生素，并通過代謝調控的方法來改造放線菌，提高抗生素生物合成，這些將會成為放線菌抗生素生物合成研究的主要方向。代謝調控技術將會為提高放線菌抗生素生物合成及開發新抗生素帶來廣泛的應用與前景。
