化石燃料的消耗和全球環境污染的加劇，使可再生、無污染的新能源開發與利用成為研究的熱點[1,2].生物柴油具有清潔性、可再生性的優點，近年來受到研究者們的廣泛關注[3].生物柴油是以動物油脂（牛油、豬油）、植物油脂（大豆油、玉米油，油棕）或者微生物油脂（微藻）等可再生的生物材料為原料的含氧清潔燃料，其主要組成成分是與石油柴油性能非常相近的脂肪酸甲酯。與石化柴油相比，生物柴油具有良好的燃燒性，高效的能量轉化率，優良的潤滑性和較高的安全性等眾多優勢[4].
它是一種無毒燃料[5],可以被生物降解，是優質石化柴油的理想替代燃料。
美國能源專家如此評價：生物柴油擁有比食鹽還小的毒性，比糖類還快的降解速度。微藻具有資源豐富、生長迅速、油脂含量高等優點，將成為生產生物柴油的重要的油脂來源[6,7].微藻是以快速生長和高能源含量著稱的單細胞光合有機體，微藻能有效利用太陽能，將 H2O、CO2和無機鹽轉化為有機物，是地球上最古老的初級生產者之一[8],是最大的自養類微生物植物[9].微藻不僅在水生生態系統如湖泊，河流和海洋中生長，而且也在極端環境如火山水和鹽水域中生長[10].我國的海岸線長，有廣闊的沿海和內地湖泊水域地區，為我國發展微藻柴油有著巨大地域優勢[11].微藻富含糖、氨基酸和高不飽和脂肪酸等，可以用于生產膳食補充劑、動物飼料、生物燃料和一些高附加值的生物活性成分[12].
微藻在自然界分布廣泛并且種類繁多，其中許多種類不僅能利用二氧化碳進行光能自養生長，同時也能利用有機碳源進行異養生長來獲取微藻生物質[13].但是自然水體中的多種微藻混合存在，采集的水樣中同時還有浮游動物（攝食者）和菌類，必須先將單個藻細胞分離出來，獲得單細胞克隆，才能夠保存和培養，進行深入研究。因此如何從原始水樣獲得單克隆藻種是微藻培養和應用的基礎和關鍵環節[14,15].
一般來說，獲得單克隆藻種需要經過水樣采集、預處理及分離等流程。本文從原始水樣的采集、樣品的預培養、純藻種的分離三個步驟對微藻不同的分離方法進行了概述。
1 樣品采集
微藻的種類繁多，廣泛的存在于自然水體中，眾多種類的微藻在自然界中存在的形式也不同，有的屬于浮游種類，有的屬于底棲附著種類[16].不同類別的生長的生態環境不一樣，因此采集的地點和方法、季節會有所不同。比如，金藻、硅藻常在低溫的季節出現，并且硅藻常附著在水體的巖石上，采集時需要用工具刮去藻體后放在采樣瓶中。又比如，藍藻通常喜歡在高溫的條件下生長，因此適合于夏季采集。有些藻類的分布還與水體的環境質量相關，眼蟲藻、衣藻、卡德藻等常在含有較多有機污染物的靜止水中出現。團藻、綠藻、藍藻、裸藻主要存在于在中度污染的水體中， 硅藻類、金藻類和甲藻類主要在清潔的水體中可以找到[17].此外，還可以利用藻類的趨光性進行初步分離采集的藻種樣品，例如可以利用顫藻的趨光能動性將其與采集附著的泥沙分離[18].總之，要得到盡可能多的微藻藻種，需要我們在采集過程中不斷摸索，不斷的進行經驗積累。
不同藻類所需的采集工具和方法也不同，浮游藻類可以采用25#浮游生物網進行采集，將采集的藻放在裝有培養基的樣品瓶中，也可用采水器進行采集獲得。常附著在水中巖石或者其他附著物（枝葉、水草）上的底棲藻類采集時可用鏟子將藻標本刮取下來放在樣品瓶中帶回實驗室。對于一些容易在短期內死亡的鞭毛藻類采集時應放在裝有培養液的樣品瓶中，并在短期內進行培養分離[19].
2 樣品的預培養
由于采集的樣品中目標藻種的密度可能比較低，分離難度比較大，分離培養也容易造成死亡，因此最好先對采集樣品進行預培養。預備培養主要包括樣品的預處理和樣品的富集培養兩個步驟。
2.1 樣品的預處理
從野外采來的水樣有時雜質比較多，有的含有沉積物、絲狀巨藻或者纖毛蟲等原生動物，如果直接用來富集培養和藻種分離，往往會導致藻種富集預培養的失敗，因此必須對采集的水樣進行初步的預處理，一般采集的水樣用 300 目的網絹進行過濾，過濾后的樣品再進行富集預培養。
2.2 樣品的富集培養
一般來說用處理過的初始樣品直接進行分離，由于樣品中藻細胞密度比較低，因此容易造成分離培養的失敗，為了避免直接對采集樣品分離培養的失敗，可先對過濾處理的樣品進行富集預培養，使樣品中的藻細胞達到一定密度后有利于目標藻種的分離培養。
根據所要分離獲得的目標藻種的種類來選擇適合不同目標藻種的生長條件和培養來進行培養，一般來說淡水中綠藻可以采用 SE 和 BG11 培養基，藍藻采用 BG11 培養基，硅藻可以采用 D1 培養基，對于海水藻可以采用 f/2 培養基。同時為了獲得盡可能多的目標藻種，我們可以把樣品分成若干份，然后分別接種于不同的培養基中進行培養，由于樣品中藻細胞濃度比較低，因此培養基中接種原始樣品的比例比較高，一般為 1/ 4~1/ 2.對于一些難以獲得的目標藻種，可以在培養基中加入適量的土壤提取液和微量元素以加速目標藻種的生長，同時接種的樣品中如果含有較多的雜菌影響目標藻類的生長，可以采用添加微量的抗生素和選擇性抑制劑的方式來抑制雜菌的生長，從而使目標藻種能夠生長起來。培養一段時間后，培養液的顏色稍有變化時，可以用顯微鏡觀察培養液中目標藻類是否占有優勢，目標藻類達到優勢時便可以進行下一步的分離工作[14].
3 分 離
3.1 微吸管分離法
將玻璃毛細管在酒精燈上加熱，用鑷子拉成極細的微管。 將微吸管放入水樣（標本）的瞬間，毛細管會自動吸入微量的水樣，微藻隨水樣被吸入毛細管，將吸入水樣（標本）吹放在載玻片上，在 10 倍或20 倍顯微鏡下觀察，在水滴中找到需要分離的目標藻種，用微吸管再次吸取目標藻種，滴在載玻片上，重復數次， 直到獲得單個的目標藻種，移入裝有經滅菌的培養基（約 1 mL）的試管中靜置培養[15].
由于吸取的藻細胞為單個藻細胞，因此該法的優點是僅用分離一次就可以獲得單克隆藻種，但是該種分離方法操作起來比較復雜，對于微小的藻細胞不好吸取，所以只適合于細胞較大的藻類[14].同時由于為單個藻細胞培養，細胞密度很低，很容易造成分離培養的失敗。
3.2 噴霧技術
Wiedemanl在上世紀60年代建立了一種簡單的分離純化方法，將待分離的藻液樣品放入滅菌的離心管中進行離心，在轉速 2 000 r/min 下離心 45~90s,倒去上清液，然后加入滅菌后的蒸餾水或者按上述步驟離心洗滌 10~12 次。將夾斷的毛細管插入離心管底部，離心管口用棉花塞住，毛細管要略長于離心管，保證毛細管一部分在棉花之上。用壓縮空氣經無菌過濾后吹在毛細管內，把從固定的離心管里的藻細胞均勻吹出，吹出的藻細胞均勻噴撒在在提前準備好的裝有滅菌的固體培養基的培養皿上。操作完成后，將培養皿放在何時的光照和溫度條件下進行培養，一段時間后，培養皿上有單藻落長出后將單藻落用毛細管跳出來接種到液體培養基中培養。
3.3 稀釋分離法
把待分離的經過富集培養的藻液樣品用滅菌過培養液進行梯度稀釋稀釋，稀釋倍數根據鏡檢情況而定，直到鏡檢時每滴藻液里只有一個藻細胞為止，將稀釋后的藻液吸取一滴接入預先準備好的裝有無菌的培養液中進行培養，培養一段時間后，當培養液中的藻細胞達到一定密度后進行鏡檢看藻液是否為單種，若為單種則分離純化成功，若不純需要繼續純化直到分離出藻液為單種為止[14,15].
此種分離方法操作比較簡便，對微藻細胞的大小沒有限制，一次可進行多個操作，成功率較高[14,15].
3.4 固體培養基分離法
3.4.1 平板劃線法
當藻細胞的直接小于 10 ?m 時，可以采用劃平板法或平板涂布分離法進行藻種分離[16].在培養基中加入含量為 1%~2%的瓊脂進行高壓蒸汽滅菌，滅菌結束后待培養液的溫度涼至大約 40~50 ℃時將培養基迅速倒入無菌培養皿中，搖勻后即制成固體培養基備用。將接種環經過酒精燈火焰滅菌后在無菌操作的條件下蘸取少量藻液以劃線的方式接入備用的固體培養基中，平板劃線可采用平行劃線、扇形劃線及其他連續劃線的方式。劃線后的平板在合適的培養條件下培養一周左右挑取單藻落接入到液體培養基中進行培養一段時間后在顯微鏡下觀察是否為單藻株，若不是單藻株繼續用上述方法進行純化，直到獲得單克隆藻種為止。
3.4.2 平板涂布法
該方法與平板劃線法相類似，只是接種時是將稀釋的藻液用涂布棒均勻的涂在滅菌的培養基表面上。涂布后的平板放在合適的條件下進行培養一段時間后，繼續上述平板劃線法中的鏡檢步驟，直到獲得單克隆藻種為止[20].
4 結束語
在自然環境中存在大量具有開發利用價值的高效產油微藻，如何從自然界水體中獲得高品質優良品質的微藻是微藻研究工作一個亟待解決的問題；同時在微藻的培養和應用中，由于種種原因，所培養的純藻種易被其他的雜藻或微生物污染，如果不及時分離純化會導致后續培養的失敗，因此采取合適的分離方法對藻種進行分離是至關重要的[15].科研工作者只有熟悉不同藻類的生態特征才能選擇正確的分離方法獲得優良的目標藻種。
