骨關節炎發病機制及治療措施的研究中經常用到細胞學水平的研究，觀察軟骨細胞的形態結構成為實驗中的一種重要的方法。在過去的研究中[1 -3]，人們對軟骨大體標本的特殊染色技術已經進行了大量的改良，并應用于骨關節炎的研究中，取得了良好的效果，但是對于軟骨細胞水平的染色技術發展緩慢，以至于無法用簡便的方法對細胞形態進行觀察，對研究造成了不便。本研究利用C57BL /6J 小鼠進行軟骨細胞的原代培養，對軟骨細胞爬片進行 HE 染色、番紅 O-固綠雙染色、SA-β 半染糖苷酶衰老染色及 II 型膠原免疫組化染色，探討這幾種染色技術在軟骨細胞爬片中的染色規律及應用價值，為骨關節炎細胞水平研究提供便利的條件。
1 材料和方法
1. 1 實驗材料
1. 1. 1 實驗動物及實驗環境： 出生 7 d 內的健康SPF 級 C57BL /6J 小鼠 12 只【動物合格證號： No:44007200018611】，雌雄不限，體重（4 ± 1） g,實驗用小鼠夠購買自廣東省醫學實驗動物中心【生產許可證號： SCXK（粵） 2013-0002; 使用許可證號： zSYYX（粵） 2013-0002】，飼養于北京大學/香港科技大學醫學中心深圳醫院實驗動物中心【使用許可證號：SYXK（粵） 2010-0106】SPF 級屏障區域的 PVC 鼠籠內，持續過濾通氣，自由飲食，清潔飲水，每日保持12 h 光照 / 黑暗循環。實驗流程和小鼠處理均遵循實驗動物管理規范條例。
1. 1. 2 實驗儀器： 高壓滅菌器（日本 Hirayama 公司） ,用于實驗材料的滅菌； 電熱鼓風干燥箱（中國精宏公司） ,用于滅菌材料的干燥； 純水機（美國Millipore 公司） ,用于試劑配制； 恒溫水浴鍋（上海百典儀器設備有限公司） ,用于試劑復溫； 生物潔凈工作臺（中國蘇凈公司） ,用于實驗操作； 微量移液槍（Thermo fisher） ,用于試劑配制及細胞培養； 高速冷凍離心機（德國 Sigma 公司） ,用于細胞離心； 培養箱（德國 Themo 公司） ,用于細胞培養； 光學顯微鏡（德國 Leica 公司） ,用于細胞觀察及拍照。
1. 1. 3 實驗試劑： II 型膠原一抗、goat anti-rabbitIgG H&L （Cy3 \ue5f8 ） preadsorbed 9 購自 Abcam 公司，生物素化兔抗山羊 IgG、SABC-POD、DAB 顯色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司，fast greensolution、safranin O solution 購自 Scytek 公司，細胞衰老 β-半乳糖苷酶染色試劑盒購自碧云天公司，Collagenase、胰 酶 購 自 Worthington 公 司，改 良 型RPMI-1640 培養基購自 HyClone 公司，青 / 鏈霉素溶液購自伊科賽公司，胎牛血清購自 Life 公司，0. 4%臺盼藍溶液購自廣州晶欣公司，二甲苯、無水乙醇、30% H2O2購自廣州化學試劑廠，蘇木素購自廣州速聚生物有限公司，中性樹膠購自國藥集團化學試劑有限公司，伊紅 Y 購自行知生物科技有限公司。
1. 1. 4 試劑配制： 軟骨細胞培養液： 改良型 RPMI-1640 培養基 90 mL,胎牛血清 10 mL; 4% II 型膠原酶消化液： collagenase 粉末 4 g,PBS 96 mL.
1. 2 實驗方法
1. 2. 1 小鼠膝關節軟骨細胞的分離培養： 取出生 7d 以內的 C57BL /6J 小鼠 12 只，全部實驗動物氣管窒息法處死，置于 75%酒精中浸泡 5 min,取出小鼠用碘伏消毒膝關節處； PBS 漂洗 3 遍各 3 min; 將組織塊剪切成 1 mm3; 加入含有雙抗的 4% II 型膠原酶中于 37℃、5% CO2培養箱中消化 4 h; 充分吹打細胞消化液，200 目過濾收集濾液； 1 500 r/min 離心5 min,無菌 PBS 清洗并離心 2 次； 棄上清液加入 6mL 完全培養基重懸細胞沉淀，接種至培養瓶中； 于37℃ 、5% CO2培養箱中培養觀察，1∶ 3比例傳代，取3 代以內的細胞進行實驗。
1. 2. 2 軟骨細胞爬片的制作： 準備多聚賴氨酸溶液浸泡后的 24 孔板大小的蓋玻片于超凈臺中晾干；5 代以內的軟骨原代細胞消化后臺盼藍計數，配制成 1 × 105/ mL 細胞懸液； 24 孔板中加入少許培養基，將細胞懸液均勻滴到玻片上； 常規培養 6 h 等到細胞貼壁后，再滴加培養基布滿整個板底，繼續培養至 24 h.
1. 2. 3 軟骨細胞的鑒定： 將分離取得的細胞 1 ×105接種到細胞爬片，靜止貼壁； 吸去上清培養基；孵育一抗，anti-collagen II antibody,37℃，1 h; PBS 輕微洗滌 3 次； 孵育 goat anti-rabbit-Cy3,37℃ 1 h; PBS輕微洗滌 3 次； 孵育 Hoechst 33258,室溫 15 min.
1. 2. 4 細胞爬片的 HE 染色： 4% 多聚甲醛固定細胞爬片 20 min,流水沖洗 3 次各 2 min,蘇木素滴染2 min,自來水返藍 2 min,80% 酒精急洗，伊紅滴染30 s.
1. 2. 5 細胞爬片的番紅 O-固綠雙染色： 4% 多聚甲醛固定細胞爬片 20 min,流水沖洗 2 min × 3,蘇木素染核 2 min,自來水返藍 2 min,番紅 O 染液滴染30 min,95% 乙醇分化 10 s,自來水洗 10 s,60℃ 預熱固綠滴染 1 min,蒸餾水急洗一次，番紅 O 染液復染30 min,95% 乙醇分化 5 s,自來水沖洗 10 s.
1. 2. 6 細胞爬片的 SA-β-gal 半乳糖苷酶衰老染色： ①染色工作液根據碧云天細胞衰老 β-半乳糖苷酶染色試劑盒說明書配制： β-半乳糖苷酶染色液 A10 μL,β-半乳糖苷酶染色液 B 10 μL,β-半乳糖苷酶染色液 C 930 μL,X-Gal 溶液 50 μL,混合均勻。②β-半乳糖苷酶染色固定液固定 30 min,PBS 洗 5 min× 3,染色工作液覆蓋爬片 37℃ 過夜。
1. 2. 7 細胞爬片的 II 型膠原免疫組化染色： 4% 多聚甲醛固定細胞爬片 20 min,流水沖洗 2 min × 3;烤片 3 min; 蒸餾水沖洗 2 次； 抗原修復； PBS 沖洗 3次； 滴加過氧化物酶阻斷劑； PBS 液沖洗 3 次； 滴加非免疫性動物血清； 滴加 II 型膠原一抗； PBS 液沖洗3 次； 滴加生物素標記的二抗； 滴加 SP 溶液； 滴加2 滴新鮮配制的 DAB 溶液。
2 結果
幾種特殊染色方法觀察軟骨細胞形態結構比較見表 1.
2. 1 倒置顯微鏡下軟骨細胞形態常規消化細胞，并用含 10% FBS 的 1640 培養基培養關節軟骨細胞，分別與 0、3、7 d 于顯微鏡下觀察細胞形態（圖 1 見彩插 6） .0 d 軟骨細胞均勻分布在培養瓶底，處于待貼壁狀態； 3 d 軟骨細胞完全貼壁，呈梭形、三角形或多角形； 7 d 軟骨細胞融合，鋪滿培養瓶瓶底。
2. 2 II 型膠原免疫熒光鑒定軟骨細胞II 型膠原是軟骨細胞分泌的特異性膠原，可利用 II 型膠原的免疫熒光對軟骨細胞進行鑒定。熒光標記后，軟骨細胞細胞核呈圓形紫藍色熒光，II 型膠原呈條帶狀紅色熒光（圖 2 見彩插 6） .
2. 3 HE 染色觀察軟骨細胞蘇木素可與核酸等酸性物質結合顯示藍色，而伊紅可與堿性蛋白物質結合顯示出紅色，進而將細胞的形態結構區分開來。染色后我們可以看到軟骨細胞的細胞核呈藍色，為圓形或者卵圓形，細胞質呈粉紅色，三角形或梭形（圖 3 見彩插 6） .
2. 4 番紅 O-固綠雙染色觀察軟骨細胞番紅 O 是堿性染料可與核酸結合顯示紅色，固綠是酸性染料可與蛋白結合將顯示藍色或者綠色。染色后我們可以看到細胞核呈粉紅色，但部分顏色被細胞質染色所覆蓋，細胞質呈藍綠色（圖 4 見彩插 6） .
2. 5 SA-β-gal 半乳糖苷酶衰老染色觀察軟骨細胞細胞衰老后，溶酶體中 β 半乳糖苷酶的表達升高，表達量越高，細胞所染顏色越重，衰老程度也越嚴重。染色后我們能夠清楚的看到細胞質綠染且顏色深淺不一，細胞核無法辨別（圖 5 見彩插 6） .
2. 6 II 型膠原免疫組化染色觀察軟骨細胞II 型膠原免疫組化染色可以特異性的定位 II型膠原的位置，蘇木素復染后可以顯示細胞核的位置。染色后我們可以看到 II 膠原表達出呈現棕黃色，而細胞核呈現紫色（圖 6 見彩插 6） .
3 討論
軟骨細胞是關節軟骨中唯一的細胞，被包埋在軟骨基質中，它可以感受機體周圍的變化，維持細胞外基質的平衡，其分泌的細胞外基質主要是糖蛋白和 II 型膠原[4].軟骨細胞的細胞核較小，呈圓形或卵圓形，有一到數個核仁，細胞可呈三角形、梭形或多角形。在軟骨組織中，越靠近周邊的軟骨細胞越幼稚，常單個分布； 越靠近中央的軟骨細胞越成熟，常多個聚集在一起[5].骨關節炎（OA） 與關節軟骨細胞的衰老和凋亡密切相關，主要表現為進行性的軟骨關節破壞，本質上是一種生物學重建過程[6].隨著我國老齡化進程的加劇，該病已經成為影響老年人健康的主要慢性退行性病變之一，但是對其發病機制仍然知之甚少，因此對該病的研究成為近年來的熱點。
目前對于動物標本的特殊染色技術發展較快，在骨關節炎領域的研究中應用廣泛。細胞學水平的研究與動物水平的研究同等重要，但是細胞染色技術發展較慢，在骨關節炎研究領域應用較少，這一方面是因為細胞染色與組織標本相比染色困難，另一方面是由于電鏡等技術的發展代替了染色對細胞結構的觀察。但是，對于軟骨細胞的特殊染色仍有其優點，比如操作簡便、價格低廉、不需要特殊的儀器設備等，這對于沒有電鏡等特殊設備的實驗室仍然是一個好的選擇。
本課題組在進行骨關節炎的研究過程中，根據研究的需要對軟骨細胞的 HE 染色、番紅 O-固綠雙染色、SA-β-半乳糖苷酶衰老染色和 II 型膠原免疫組化染色條件進行了探究，取得了良好的效果。
蘇木素-伊紅染色技術是病理技術中最經典的染色方法，是由 Waldeyer 于 1863 年首先提出來的，一直沿用至今。常規的 HE 染色是根據蘇木素和伊紅兩種染料對酸堿性物質的親和性不同而著色，蘇木素可與核酸等酸性物質結合，從而使細胞核呈現藍色，而伊紅可以與細胞質中的堿性蛋白物質結合，顯示出紅色，進而將細胞的形態結構區分開來[7].我們可以看到，在軟骨細胞爬片的 HE 染色中，細胞核與細胞質結構清楚，單個細胞的輪廓也清晰可辨，是一種觀察細胞形態較好的染色方式。
番紅 O-固綠雙染色中，番紅 O 是堿性染料可與核酸結合將細胞核紅染，固綠是酸性染料可與蛋白結合將細胞核染成藍色或者綠色[8].在軟骨細胞爬片中，可以分辨出細胞核與細胞質的結構，但分辨率不如 HE 染色清楚，這種分辨情況與軟骨組織中兩種染色的分辨情況正好相反，這可能是由于固綠與番紅 O 相比更容易著色，而綠色可以覆蓋部分紅色使得結構相對不太清晰。但是，該染色在軟骨細胞或軟骨組織中是一種特異性的染色，其使用率較高，通過我們在軟骨細胞爬片上的實驗也得到了預期的效果，可以在軟骨細胞中加以應用。
β-半乳糖苷酶是檢驗細胞衰老的一種特異性的標志酶，由 Dimri 等[9]在 1995 年首次提出，衰老軟骨細胞在 pH 6. 0 時會表現出溶酶體 β-半乳糖苷酶活性的升高，衰老的軟骨細胞可以表達此酶，通過對不同階段的軟骨細胞的衰老染色情況進行分析，可以得到軟骨細胞的衰老情況，從而確定不同狀態下軟骨細胞老化的速度及程度[10].通過實驗結果我們可以看到，由于 β-半乳糖苷酶表達量的升高，細胞質被染成綠色，并且當細胞衰老程度越嚴重時，綠色越明顯，而未衰老的細胞則無此染色。該染色在反應細胞的形態結構方面不清楚，無法分辨細胞核與細胞質。
II 型膠原是軟骨細胞分泌的特異性物質，通過II 型膠原免疫組化染色可以對軟骨細胞進行特異性的定位，對 II 型膠原的分布及定量作用明顯，通過蘇木素的復染，可以分辨其余細胞，作用很大。我們通過染色發現，II 型膠原表達處呈現棕黃色，而通過蘇木素的復染，細胞核呈紫色，從而清晰的分辨出細胞核與細胞質。由于 II 膠原只是細胞分泌的細胞外基質中的部分成份，該染色無法顯示細胞質中的其他成份，所以單個細胞的形態不是很清楚。
該染色在 II 型膠原特異性的定位及定量作用比較明顯。
綜上所述，各種染色方法各有優缺點，但在軟骨細胞形態觀察方面，HE 染色和番紅 O-固綠雙染色分辨細胞比較清楚，可以獲得更加全面的信息，尤其以 HE 染色最佳； SA-β-gal 半乳糖苷酶衰老染色對于衰老軟骨細胞的數量及軟骨細胞衰老程度的檢測用處較大； II 型膠原免疫組化染色則可以用于 II 型膠原的定位與定量。我們在使用軟骨細胞進行研究時，可以綜合采用多種染色方法。
參考文獻：
[1] 黃云梅，陳文列，黃美雅，等。 多種特殊染色法在骨關節炎組織形態學研究中的應用比較 [J]. 中國比較醫學雜志，2011,21（5） : 45 - 49.
