茶葉生物化學是研究茶樹生命化學的科學，在生物化學與分子水平探討茶樹生命的本質，研究茶樹特別是茶樹新梢中分子的結構與功能、物質代謝與調節，及其在生命活動中的作用；研究茶樹新梢的化學分子在加工及貯藏過程中的轉化規律以及對茶葉品質及茶葉健康功能的影響；茶葉生物化學是茶學發展的基礎科學。茶葉生物化學的研究成果為茶樹栽培和育種、茶葉加工及深加工、茶葉貿易和文化提供了堅實的理論依據。茶葉生物化學研究的不斷深入為茶產業的發展提供了動力源泉。
作為葉用植物，茶樹新梢是茶樹代謝最為旺盛的部位之一，在次級代謝上有其獨特性，具體表現在新梢含有極其豐富的兒茶素、咖啡堿和茶氨酸等特征性次級代謝產物上，因而它們在茶樹體內的生物合成及其在制茶過程中的轉化等機制研究是茶葉生物化學的核心問題。近年來，茶樹功能基因、次級代謝關鍵酶及基因、茶葉代謝譜、茶葉功能成分與健康等的相關研究呈現爆發式增長。本文就近五年來茶葉生物化學研究主要的進展內容綜述如下。
1 茶樹次級代謝途徑的研究
植物次級代謝是植物在進化中與環境相互作用的結果。與其他植物比，茶樹次級代謝的特點是，富含兒茶素、咖啡堿和茶氨酸等特征性次級代謝產物。近年來，茶樹次級代謝研究主要集中在這些特征性次級代謝產物兒茶素、咖啡堿和茶氨酸的代謝途徑中的關鍵酶及相關基因的研究，已取得一些重大進展。
1.1 茶樹中兒茶素代謝相關研究進展
兒茶素類物質（黃烷-3-醇）對茶葉品質和健康功效的貢獻度極高，其代謝特別是合成代謝一直是茶樹次級代謝研究的重中之重。兒茶素由莽草酸途徑合成而來，近年來兒茶素 B 環5′羥基化途徑和 C 環沒食子?；緩揭殉蔀閮翰杷仡惢衔锖铣纱x研究中的重點[1].2004 年，Punyasiri 等的研究表明，在茶樹兒茶素合成途徑中，EC 和 EGC 是由花白素經花青素合成酶（ANS）和花青素還原酶（ANR）的二步催化形成[2],而不是由兒茶素和沒食子兒茶素直接表構而成，但兒茶素的沒食子?；芯咳允强瞻?。新近夏濤研究小組發現，酯型兒茶素合成以非酯型的 EC 和 EGC 為前體，涉及兩步合成反應，即沒食子酸首先在沒食子?；?1-O-β-D-葡萄糖基轉移酶（UGGT）催化下，被活化形成 1-O-沒食子酰-β-葡萄糖（βG），以此作為活化的?；w（1-O-Glc esters），再在 1-O-沒食子?；?β-D-葡萄糖-O-沒食子?；D移酶（ECGT）作用下，將沒食子?；D移到順式非酯型兒茶素的 C 環 3 位上而形成酯型兒茶素 ECG 和 EGCG（圖 1）[3].此外，該研究組還發現了高活力的酯型兒茶素水解酶（GCH），該酶可能屬于單寧酶類，可水解酯型兒茶素為沒食子酸和非酯型兒茶素。兒茶素還可進一步聚合形成原花青素（PAs），在茶樹根和莖中大量積累，而葉片中含量很低[4].
上述研究結果為茶樹酯型兒茶素的合成與轉化提供了較為清晰的途徑。
兒茶素代謝途徑受到多種轉錄因子的調控。安徽農業大學茶葉研究小組發現相關轉錄因子 MYB、WD40 和 bHLH 等參與了茶樹中多酚類物質的代謝調控[5].此外，還對茶樹發育相關和組織特異性相關的酚類物質積累模式、63 個酚類物質合成相關結構基因和轉錄因子基因表達模式進行了相關分析[6].
利用體外表達手段（原核與真核），對酚類物質合成關鍵酶基因 CAD（肉桂醇脫氫酶）、ANR1、ANR2、DFR1、DFR2、LCR1、F3H、F3′5′H、MYB5 功能進行了有效鑒定。Umar等[7]利用茶樹 F3H、DFR 和 LCR 構建了大腸桿菌基因工程菌，以圣草酚（3′，4′，5,7-四羥基黃烷酮）為底物合成了 EC、ECG、（+）-C和 CG.
茶樹中兒茶素的合成代謝還受到外界環境的影響。Rani 等對茶樹兒茶素合成途徑中的關鍵基因 F3H、DFR、ANS 和 ANR 的表達，以及干旱、脫落酸、赤霉素、傷害處理對其表達影響進行了研究分析[8].劉仲華研究組以白化茶樹品種為研究對象，發現苯丙氨酸裂解酶（PAL）基因和黃酮醇合成酶（FLS）基因表達與兒茶素濃度呈負相關，而黃烷酮-3-羥化酶（F3H）基因表達呈正相關[9].夏濤等發現大田遮蔭處理可使茶樹酚類物質中的黃酮醇、原花青素合成顯著下降；但兒茶素和木質素總量稍下降，而對 EGCG 含量影響最小[10].進一步發現黑暗培養的茶愈傷組織移至光下培養后，木質素、花青素、兒茶素的積累量明顯增加。與黑暗處理相比，弱光處理后茶籽苗中非酯型兒茶素含量增加，酯型兒茶素積累卻顯著下降[11].
1.2 茶樹中咖啡堿代謝相關研究進展
咖啡堿（1,3,7-三甲基黃嘌呤）代謝與腺嘌呤核苷酸代謝密切相關。茶樹咖啡堿主要在幼嫩葉片和茶花中進行生物合成，合成部位可能在葉綠體。2000 年，Kato 等從茶樹葉片中純化出 咖 啡 堿 生 物 合 成 關 鍵 酶 咖 啡 堿 合 成 酶（3-NMT+7-NMT），并對該酶基因進行克隆和測序[12].植物體內咖啡堿生物合成的核心途徑為：黃嘌呤核苷→7-甲基黃嘌呤核苷→7-甲基黃嘌呤→可可堿→咖啡堿，其中包括 3 步由N-甲基轉移酶催化的轉甲基化反應和 1 步由核糖核苷水解酶催化的脫核苷反應（圖 2[13]）；而咖啡堿的降解主要路徑為咖啡堿→茶葉堿→3-甲基黃嘌呤→黃嘌呤→尿酸→尿囊素→尿囊酸→尿素→NH3+CO2[13].
近年來相關研究主要集中在咖啡堿代謝途徑中關鍵酶及其基因的的克隆、結構與功能的關系以及表達調控機制等。通過克隆源自咖啡的黃嘌呤核苷甲基轉移酶基因（CaXMT1）和源自茶樹的咖啡堿合成酶基因（TCS1）導入酵母中進行組合表達后，飼喂黃嘌呤核苷（XR）和 SAM,成功合成了咖啡堿[14].劉祥琦通過疑似 N-甲基核苷水解酶基因（STx）的克隆和大腸桿菌表達發現該酶具有催化 XR脫核糖反應的功能[15].金基強等從白葉一號茶樹中，獲得了 6 種 NMTs 的基因組 DNA 全長，發現了 3 種 TCS3、TCS4 和 TCS5 基因[16].魏艷麗從茶樹中克隆出了 AMP 脫氨酶基因的cDNA 全長（GenBank:AGJ84350.1）[17].
由于一些特殊人群對咖啡堿敏感，低咖啡堿茶樹品種的選育一直是科研工作者的目標之一。Mohanpuria 等采用 RNAi 技術培育出TCS 基因沉默的轉基因茶樹植株，咖啡堿和可可堿的含量與對照比分別下降了 44%~61%和46%~67% ;同時，還利用農桿菌侵染導入RNAi 片段，使得茶樹幼苗新梢中咖啡堿和可可堿含量最高分別下降了 67%和 61%[18-19].
1.3 茶樹中茶氨酸代謝相關研究進展
茶氨酸（N-乙基-γ-L-谷氨酰胺）系茶樹特征性非蛋白質氨基酸，主要通過茶氨酸合成酶 TS 催化谷氨酸和乙胺合成茶氨酸，現已在Genebank 登錄的 TS 基因有 3 條（DD410895,DD410896、JN226569）。盡管這些基因序列和植物中的谷氨酰胺合成酶（GS）序列高度同源，但通過大腸桿菌和擬南芥體外功能驗證實驗已先后證明其具有 GS所不具備的體外合成茶氨酸的能力[20].TS1 主要在根部和葉部高表達；TS2 在盛花期表達量最高；TS3 的表達量在單芽萌發階段和主側根中最高（結果未發表）。茶氨酸的合成具有明顯的時空特異性，參與多個器官的氮素貯藏與轉運，受到復雜的分子調控。
茶氨酸的合成還受到諸多生物和非生物因素的調控。鹽脅迫、外源施加 ABA、NO 等激素信號分子也會促進茶樹體內茶氨酸大量積累，說明茶氨酸與茶樹抵御逆境脅迫息息相關，通過染色體步移技術克隆到 TS 基因的啟動子區域，發現多個響應光調節、激素調節和逆境脅迫等的順式作用元件，若對其進行深入研究與驗證，將有助于解析茶樹體內大量積累茶氨酸的生物學意義[21].
1.4 茶樹萜烯類香氣物質代謝研究進展
茶鮮葉中含有 30 余種糖苷態萜烯類香氣物質，如芳樟醇及其氧化物和香葉醇等。這些揮發性萜類及其糖苷的含量和水解對成品茶的香氣類型有重要影響。植物經 2-C-甲基-D-蘚糖醇-4-磷酸（MEP）和甲羥戊酸（MVA）途徑合成萜烯類物質。單萜和倍半萜合成酶是揮發性萜類化合物生物合成途徑中的關鍵酶；糖基轉移酶可能與茶鮮葉中糖苷態萜類香氣化合物的合成和積累有關；而糖苷水解酶則催化糖苷態香氣物質的水解，導致香氣物質的釋放[22].Yang 等[23]對茶樹中的香氣物質生物合成途徑進行了系統總結，如圖 3 所示。
茶樹中萜烯類物質合成途徑中的相關酶基因報道較少，而更多地側重在糖苷水解酶相關基因的研究。陳亮等研究發現，8 個品種中茶樹 β-葡萄糖苷酶基因表達量是 β-櫻草糖苷酶的 2.4~45.6 倍，但 β-葡萄糖苷酶活性測定結果與基因表達量之間的相關性不明顯[24].
1.5 茶樹基因組研究進展
現代生物技術的迅猛發展為茶樹次生代謝的研究提供了重要的技術手段和方法。雖然茶樹次級代謝的分子生物學研究起步較晚，但目前仍是茶葉學科中最活躍和進展最快的一個領域。在此領域中業已分離和篩選出茶樹特征性次級代謝物的相關功能基因，并對其功能進行了研究。
在茶樹分子生物學研究中，AFLP、RAPD、RFLP 和 EST-SSR 等技術等已成功應用于茶樹DNA 分子標記，構建了茶樹次級代謝物差減雜交 cDNA 文庫、龍井 43 新梢和幼根的 cDNA 文庫和阿薩姆雜交種 TV-1 嫩梢的 cDNA 文庫[25];并利用 cDNA 芯片技術獲得了安吉白茶不同白化期的 671 個差異表達基因[26].Wu 等利用454 測序技術對茶樹葉部的轉錄組進行了研究，獲得了 25 637 個編碼基因（unigene）和3 767 個 EST-SSRs 標記[27].李娜娜等利用Solexa 法對福鼎大白茶和小雪芽品種葉部的轉錄組進行了研究，獲得了 79 797 個 unigenes和 6 439 個 SSRs 標記[28].
2009 年，安徽農業大學茶葉重點實驗室啟動茶樹基因組研究計劃，對 2 個栽培種和 1 個古茶樹進行了 45 倍深度基因組測序，獲得了基因和分子標記信息，為茶樹基因組序測序方法和材料選擇上提供了重要依據；同時進行了茶樹全器官轉錄組與功能表達譜研究[29];以茶樹帶芽莖段為外植體建立了離體再生體系[30].這些研究結果為進一步揭示茶樹優質、高產和抗逆的分子機理提供了重要的基礎數據與平臺。
2 茶樹次級代謝譜的研究進展
近年來，茶樹次級代謝的研究還體現在特征性次級代謝物的代謝譜研究上，包括特異性種質資源代謝譜、茶葉加工過程代謝譜和環境以及農藝措施對茶樹代謝譜影響等相關研究。
2.1 特異性種質資源代謝譜的研究
張凱等[31]在川渝地區 11 種野生大茶樹中發現南川 1 號中 EGCG 含量大于 13%,南川 1號和 2 號中咖啡堿含量高于 5%和咖啡堿含量僅有 0.32%的黃山苦茶等特異性資源。謝吉林等[32]研究了滇西南茶區的 468 份曬青毛茶樣品，發現咖啡堿含量春茶最高，夏秋茶依次下降，且咖啡堿的含量與游離氨基酸總量存在顯著相關。貴州綠茶樣品中兒茶素和咖啡堿含量分別在 9.14%~27.28%和 1.08%~3.33%之間[33].Kilel 等[34]發現，與中國的 Hanlu 種和日本的 Yabukita 種相比，肯尼亞 12 個紫芽葉品系綠茶中總多酚含量更高，10 個品系茶氨酸較高。
從紫色芽葉中還分離鑒定了 7 種花色素物質，其中錦葵素的含量最為豐富。在同一品種中，兒茶素含量和花青素含量存顯著負相關[35].Wang 等[36]通過 119 份茶樹種質資源研究發現，阿薩姆種中 β-胡蘿卜素和葉黃素含量最高。
2.2 茶葉加工和貯藏過程中代謝譜的變化
王秀梅[37]研究發現，祁門紅茶加工揉捻過程中醇類和醛類香氣成分大幅增加，而酮類和烷烴類變化不明顯；多糖類含量呈下降趨勢，單糖含量略有增加；生物堿基本保持不變，干燥后氨基酸含量變化明顯。陳紅霞對普洱茶渥堆發酵過程進行檢測發現，在渥堆發酵過程中，兒茶素類、黃酮醇類和茶氨1主體，酯型兒茶素和茶氨酸中無檢出，纈氨酸含量持續增加；嘌呤堿中的咖啡堿和可可堿含量無顯著改變，而黃嘌呤、次黃嘌呤、腺嘌呤、鳥嘌呤、甜菜堿等含量則不斷增加。
此外，姜姝等和呂昌勇還分別對普洱茶不同發酵時期微生物群落的宏轉錄組和宏基因組學進行了研究。Ku 等[39]利用 LC-PDA-ESI/MS 技術比較了不同貯藏年限的 18種普洱生茶和 12種普洱熟茶中的代謝譜，發現木麻黃素、三沒食子酰葡萄糖、綠原酸、EGC、ECG、EGCG 和茶沒食子素在生茶中含量較高，而熟茶中 GA 含量較高；生茶中，隨著貯藏年限的增加，EGCG、ECG、EGC、奎寧酸、綠原酸和木麻黃素顯著降低，而 GA 顯著增加；而不同貯藏年限的熟茶間主要化合物差異不明顯。曹艷妮[40]
用SDE-GC-MS 比較了 10 種普洱生茶和熟茶的香氣，發現生茶獨有組分 13 種，而熟茶獨有組分有 36 種；生茶以具有木香、花香的萜烯類和具有強烈新鮮香氣的二氫獼猴桃內酯為主，而熟茶則以具有霉味和陳香的甲氧基苯類為主。
近年來，兒茶素物質在黑茶加工過程中的轉化產物受到了特別關注。經渥堆發酵后的黑茶中出現了許多結構奇特的兒茶素類衍生物。
據報道，普洱茶中的這類衍生物包括普洱茶素A（1）和 B（2），普洱茶素 I-VIII（3-10）等新化合物，以及表兒茶素-[7,8-bc]-4α-（4-羥苯基）-二氫-2（3H）-吡喃酮（11）和 cinchonain lb（12）等[41-42].茯磚茶中發現的兒茶素衍生物則包括新化合物茯磚素 A-F（13-18），plancholA（19），文冠木素（20），teadenol A（21）等（圖 4）[43-44].普洱茶中主要是兒茶素 A 環通過碳碳鍵連接新的基團，而茯磚茶中的衍生物則主要是兒茶素 B 環裂環后的產物。這很可能是源于兩種黑茶中不同的微生物優勢菌群。
2.3 農藝措施對茶樹代謝譜的影響
楊亦揚等[45]利用1H-核磁共振（1H-NMR）的代謝組學非靶標分析與 HPLC 定量分析結合，研究了不同施氮水平對白天和夜晚茶樹新梢代謝譜的差異，表明晝夜主要差異組分為茶氨酸、谷氨酸、葡萄糖、蔗糖、EC 和 GC;而不同施氮水平對天冬氨酸和兒茶素組分影響顯著。
Yang 等[46]利 用 UPLC-TOF-MS 、CE-TOF-MS（毛細管電泳飛行質譜聯用）、HPLC 和 GC-MS 等技術，對遮蔭 3 周后的藪北種新梢進行化學分析后發現，揮發性脂肪酸衍生物（如：2-己醛、2-戊烯-1-醇、3-己烯醇乙酯、（Z）-3-己烯-1-醇、壬醛、壬醇和辛醇）和苯丙素類/苯環型揮發物（VPBs,如苯甲醛、水楊酸甲酯、苯甲醇、2-苯乙醇）等顯著提高；而（S）-芳樟醇、順式或反式芳樟醇氧化物（呋喃型和吡喃型）、橙花醇、香葉醇、α-萜品醇和橙花叔醇等萜烯類香氣組分和糖苷類香氣前體變化不顯著；進一步研究發現，遮蔭處理后 VPBs 合成的上游前導物如莽草酸、預苯酸和苯丙酮酸含量顯著降低，但 VPBs 合成另一前導物氨基酸中的絕大多數氨基酸（含 L-苯丙氨酸）的含量則顯著增加；生物堿中的咖啡堿含量增加，而可可堿含量降低；遮蔭處理除琥珀酸和 GABA 略有降低外，對 TCA 循環其他代謝物無明顯影響；兒茶素含量顯著下降。
3 茶葉品質化學研究進展
近年來，隨著茶葉分析技術的快速發展，茶葉品質化學的研究得到進一步加強。
3.1 兒茶素氧化縮聚產物的研究
茶鮮葉中兒茶素在紅茶和黑茶的加工過程中發生了劇烈的氧化聚合和縮合反應，產生了茶黃素、茶紅素和茶褐素等氧化產物。Sang等[47]綜述了茶葉成分化學及其生化轉化，兒茶素不僅可發生 2 聚合反應生成茶黃素，而且茶黃素還可進一步與兒茶素反應，形成具有 2個或 3 個苯駢卓酚酮結構的化合物，如圖 5.
這些結果表明茶黃素類可進一步參與茶紅素的形成。據報道，茶紅素主要由分子量在 2 100 Da以下的化合物聚合而成，這些化合物主要由兒茶素及其沒食子酸酯、酚酸和茶黃素等組成，并且可能是多羥基化的寡聚體[48].
3.2 茶葉苦澀味研究
我國生產的大部分夏季綠茶滋味較春茶偏苦澀。2005年德國學者 Scharbert和 Hofmann通過對紅茶內含成分的分離和測定，結合感官分析，確定了引起紅茶中澀味的主要物質為EGCG 和黃酮醇苷，苦味物質是 EGCG 和咖啡堿[49].宛曉春研究組收集測定了我國綠茶主產區 160 個春季和夏季綠茶樣品中主要呈味成分，并結合感官定量評定法和數據判別分析，發現夏季綠茶中茶多酚和咖啡堿含量較高，而茶氨酸和其他氨基酸含量偏低，這可能是導致夏季綠茶苦澀味偏重的主要原因[50].在加工過程中，通過改進攤放工藝、殺青工藝、揉捻工藝以及添加外源酶等可減輕成品茶的苦澀味。
3.3 茶葉香氣化學的研究
袁海波等、施夢南和龔淑英以及 Yang 等對茶葉香氣物質的生物合成、加工過程對成茶香氣形成的影響、茶葉香氣的特征和茶葉香氣的分析檢測方法等方面，進行了較為系統的綜述。Yang 等[23]歸納總結了茶湯中部分特征性香氣物質的香型及閾值（表 1）。
3.4 茶葉化學品質差異研究
李萬春[51]利用衍生化 GC/MS 方法，對 18個烏龍茶（12 個鐵觀音和 2 個水仙）、3 個綠茶、1 個白茶和 2 個紅茶樣品進行了代謝譜（糖類、有機酸、氨基酸和咖啡堿）分析，結果表明鐵觀音和水仙能清楚分類，紅茶和其他茶類差異最大。Zhang 等[52]應用 GC-TOF-MS 和LC-Q-TOF-MS 技術檢測了 12 種綠茶、12 種烏龍茶和 9 個紅茶的代謝譜，分別獲得 1 812和 2 608 個特征峰，在 3 類茶中共篩選出 90種存在顯著差異的化合物，其中包含兒茶素、氨基酸、糖、有機酸和黃酮苷類等成分。葉茂[53]比較發現了 22 種普洱茶的化學成分與 1 種西湖龍井和 1 種立頓紅茶有顯著差異，且不同品種、產地、年份的普洱茶中的化學成分差異顯著。
近紅外光譜技術（NIR）具有快速和無損分析等優點，近年來在成品茶和茶鮮葉品質的的研究上亦取得重要進展。NIR 技術已嘗試應用于茶葉含水量、咖啡堿、茶多酚、茶黃素和茶紅素、總氮量、纖維素、茶葉抗氧化活性等方面的快速檢測；NIR 技術還應用于茶葉等級、茶葉種類、茶葉真偽等方面的判別上；此外，NIR 技術在茶鮮葉質量評價（嫩度、勻凈度和新鮮度）上[54]和茶鮮葉產地判別上[55]也進行了嘗試。近年來計算機成像技術和數字處理技術的有效結合，已初步應用于茶葉加工過程中的品質控制和茶葉分級[56].
參考文獻
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