膜蛋白是生物膜功能的主要承擔者，根據膜蛋白的分布，膜蛋白可以分為三類： 外周膜蛋白、整合膜蛋白和脂錨定蛋白。膜蛋白的功能具有多方面性，有些膜蛋白可以作為載體而將物質轉運出細胞；有些膜蛋白是激素或者其他化學物質的專一受體；有些膜蛋白作為專一的酶催化專一的化學反應。因此細胞的許多功能是通過細胞膜上膜蛋白結構的改變來實現的，而研究膜蛋白的結構便成為了研究膜蛋白功能的重要手段。
迄今為止電鏡三維重構技術解析蛋白質結構技術主要分為兩種： 單顆粒三維重構技術 （ singleparticle analysis ）[1],電 子 斷 層 三 維 重 構 技 術（ electron tomography,ET）[2],以及基于這兩種方法的其他方法[3,4].對于具有全同性或高對稱性的蛋白質復合物和病毒，可以在純化分離后，采用單顆粒三維重構技術獲得其三維結構，并可達到 0. 4 nm 或更好的分辨率[5 ~9].但樣品重構過程中需要平均大量的分子，因而單顆粒電鏡研究方法并不適用于非均一結構的蛋白研究，而且蛋白純化后脫離了完整的細胞環境，不可避免地會發生蛋白結構的改變[10].電子斷層技術作為一種從材料科學到生物學都行之有效的技術[10,11],可以得到微觀物體的三維密度分布圖。在生物學應用中，電子斷層技術旨在接近天然條件下研究具有獨特結構的物體的三維形態，可以用來研究不具有全同性的超分子體系和亞細胞體系以及研究膜蛋白在膜上的分布和膜蛋白與膜之間的關系，且電子斷層成像技術被認為是用來原位研究膜蛋白結構的唯一方法。但斷層成像方法的分辨率卻遠低于單顆粒方法。因此電鏡單顆粒重構和斷層成像在結構研究上有很大的互補性，將二者有機的結合起來[12],是目前獲得生物體系原位高分辨率三維結構很有潛力的研究方法。
1 成像原理技術簡介
電子斷層技術已經成為一種在納米級分辨率下探索細胞結構的新興的有效方法?？梢酝ㄟ^加權背投影方法從 2D 投影圖像重構出樣品的 3D 圖像。通過獲取同一物體的多個連續角度下的二維投影圖反向重構出它的三維結構。簡單之，電子斷層技術就是將一個樣品沿著一個與電子束垂直軸旋轉，每旋轉一個角度，采集一個物體相對應方向的二維投影圖像，通過計算機對這些 2D 圖像進行處理，將不同角度的 2D 投影圖像反向重構出樣品的 3D 結構的技術。
樣品電子斷層的一個主要特征是分辨率的各向異性，x 軸和 y 軸的分辨率相對較高，而 z 軸的分辨率較差。另一個特征是 ET 的傾斜角范圍為 ± （ 65°~ 70°） ,最基本的原因是樣品在高傾斜角時，樣品的厚度迅速增加，遠遠超過電子穿透能力。因此會出現高角度投影缺失的現象，這個現象被稱為“失蹤楔”.由于失蹤楔的存在導致 z 軸的分辨率降低。
為了減少失蹤楔的影響，數據采集時可以采用雙軸傾斜法[13,14],第二個傾斜軸垂直于第一個傾斜軸。盡管各向異性不能完全消除，但使信息丟失區域由“失蹤楔”減小到“失蹤角錐”,提高了重構后結構的總體質量。
單顆粒方法是對分離的，非有序排列的，具有結構均一性的蛋白顆粒進行解析。其所用的原理是通過對相同的生物大分子某方向的投影電子顯微圖像在空間中進行調整后進行疊加平均，從而提高信噪比，使粒子中共同部分的結構信息得到加強，最后對各種不同投影方向的單顆粒電子顯微圖像在三維空間中進行重構，從而獲得單顆粒大分子的三維結構信息。
2 制樣方法
2. 1 CET 的冷凍制樣
雖然在過去的這么多年中傳統制樣方法已經證明了其在電鏡領域的作用，但是在脫水和固定這樣的關鍵步驟上仍然引起人們的關注。這使得在 20世紀 80 年代形成了一種被稱為冷凍制樣的替代方法。在冷凍電鏡中，樣品仍然維持其含水狀態，只是使液態水變成了非冰晶態的玻璃態。在整個實驗過程中包括 TEM 成像，樣品必須保持低于不透明的水溫之下（ -135 ℃） .在樣品的制備中，由于冰晶會破壞生物結構，所以可利用提高冷卻率來阻止冰晶的形成。液體冷凍劑（ 液體乙烷） 可以提供足夠的冷卻速率來實現水的玻璃化，冷凍深度大約可達到1 μm.對一些厚度較大的樣品，樣品的玻璃化通常需要其他方式實現。最常用的是高壓冷凍（ HPF） 方法： 壓力在數毫秒之內達到 200 MPa.這種方法可以使樣品表面下 100 ~ 300 μm 內實現玻璃化[15].
隨后玻璃化部分（ 25 ~ 100 nm） 必須用冷凍超微切片機切割，并在冷凍電鏡下觀察，整個過程中樣品必須保持在冷凍狀態[16].聚焦離子束銑削（ focused-ion beam milling,FIB） 是一種切割超薄切片的方法，在削薄冷凍樣品中已經表現出其應用，這個方法是用聚焦離子去侵蝕樣品直到達到所需的厚度[17].但在銑削這個過程中大部分樣品會丟失。FIB 最大的優勢是可以得到足夠薄的樣品切片且沒有由于切割而引起的結構損害。FIB 銑削在那些可以犧牲大部分樣品且不影響研究結果的情況下可以取代冷凍切片。
冷凍固定后的樣品也可以進行常規處理。冷凍置換（ freeze substitute） 是在低溫下用包含固定液和染色溶液的有機溶劑將冷凍組織的水逐漸溶解的一個過程[18].然后再進行傳統的包埋、切片等步驟。這種方法在細致結構的保護上也有較好效果，而且降低了冷凍切片和冷凍電鏡下觀察樣品帶來的技術要求。
2. 2 單顆粒制樣
首先用溶劑溶解膜蛋白提取膜蛋白溶液，經過多次純化后得到高濃度的膜蛋白溶液?？焖倮鋬鲋茦臃椒ㄊ菍⒑猩锎蠓肿訕悠返娜芤悍稚⒃诤形⒖椎奶贾文ど?，利用濾紙吸去多余的液體使得支撐膜表面形成一層非常薄的溶液，然后將其以非?？斓乃俣冉氲奖灰旱鋮s的冷凍劑如液態乙烷中。液態乙烷的高熱容保證了樣品溫度快速下降并防止冰晶的產生，樣品中的水形成了一種非晶態的冰，然后樣品在低溫條件下被送入到冷凍電鏡中觀察。在樣品進入電鏡之前為了增加樣品對電子的耐受性，樣品可以進行負染或者進行冷凍制樣。這兩種方法都有自己的優缺點[19,20].
3 三維重構。
3. 1 電子斷層成像三維重構
在傾斜圖像收集過程，傾斜角度通常達到最大，單軸傾斜角度為 75°的分辨率大約和雙軸傾斜角度60°時的分辨率相同。但傾斜角在 60° ~ 70°時只有厚度較小的樣品才可以使用，因為在高角度時由于樣品的厚度迅速地增加導致圖像的質量降低。因此在 60° ~70°時使用雙軸傾斜可以提高圖像的質量。冷凍樣品采樣過程是對同一個區域進行照射，而冷凍含水樣品存在的一個問題就是對電子敏感性特別高，高通量的電子照射往往損害樣品的超微結構。因此為了防止樣品細節丟失或者結構的變形，總電子劑量必須控制在 80 ~100 e-/ \ue6a62之下。
三維重構前的第一步是圖像的對齊。圖像的對齊是通過旋轉、轉換和放大修正等過程來實現。對齊中最常用方法是利用樣品中的膠體金或者支持膜來定位，膠體金必須足夠大以至于在圖像中能清晰看到，理想直徑為 10 ~ 20 nm.但這也并不是唯一的標準，如果所要檢測的蛋白顆粒接近膠體金直徑，應該適當地調整膠體金顆粒。對齊過程中所選用的膠體金標記最少應在 8 ~10 個并且均勻分布在圖像中。然而有時很少的膠體金也能產生較好的效果，對齊的準確度通常隨著膠體金個數的增加而增加，理想的對齊是每個膠體金都能在整個傾斜系列中被跟蹤，但是大多數的對齊程序都能適應部分膠體金的缺失?？傊?，在對齊過程中，膠體金對于低電子密度圖像極其重要，膠體金是傾斜圖像跟蹤的最明顯特征。
分析電子斷層重構數據的第一步是分析 z 軸的2D 傾斜圖片，這個方向的圖片特征更加明顯。體渲染和表面渲染是兩種重要的斷層數據展示方法。體渲染是把立體強度轉換成透明值，然后轉換成亮度。它的優點是利用了所有的數據，避免了主觀分割。
透明化后的缺點來自于樣品結構的重疊導致對其結構分析變得很困難。體渲染對于子結構的重構非常有用。而由于表面渲染減小了視覺上的物理差距，因此表面渲染更加常用一些。
分割是重構數據展示過程中最重要且最耗時的一個過程，包括手動分割、自動分割和半自動分割。最簡單的方法是手動分割，但手動分割耗時多且主觀性較強。半自動分割減少了實驗者的工作量，但由于冷凍含水樣品的低信噪比和低對比度增加了半自動分割的難度，目前很多軟件正在克服這些難點。自動分割是利用密度閾值設置一個表面的等值面。
對于有較好對比度的樣品時可以取得較好的效果，但背景較復雜和低對比度的樣品時，通常需要設定多個閾值。模板匹配是基于對靶結構了解的基礎上對目標進行分割[21 ~23],X 射線晶體學或者單顆粒方法可以得到分辨率較高的細致結構，因此結合高分辨率的樣品對斷層進行分割是一種比較實用的方法。
3. 2 子斷層數據的單顆粒三維重構
單顆粒分析由三部分組成，分別為子斷層照片的提取，對齊（ 3D 旋轉和轉換的應用） 和計算平均值。為了方便子斷層照片后期的 3D 對齊過程，提取的子斷層照片必須以立體的形式呈現。如果所選擇的蛋白有一個較長的形狀，必須選擇一個包含多個膜蛋白的邊界框。操作過程必須按照以下步驟進行，對于每一個坐標的三聯體，計算左上角且提取子斷層照片。在對齊之前，大部分斷層照片需要逆轉對比度和像素值。在對齊過程中，降低 3D 參考物的影響有： （ 1） 在 3D 對齊過程中使用幾種不同的參考直至出現的結果較穩定。（ 2） 挑選的顆粒最好在中心位置。因此 3D 旋轉對齊計算出的平均值可以作為下一次 3D 對齊的參考物。在對齊整個子斷層照片過程中，為了修正子斷層照片的方向和位置需要進行一系列連續的旋轉和對齊操作。每次 3D 對齊循環結束后計算出平均值作為下一次循環的參考?，F在一些軟件都能很好地處理單顆粒的三維對齊過程[24 ~26].
3. 3 單顆粒的三維重構
單顆粒的三維重構主要包括以下幾方面： 評估圖像； 反差轉換函數（ contrast transfer function,CTF）校正； 顆粒的選擇； 2D 分析； 生成初始模型； 模型精修。（ 1） 評估圖像。在選擇顆粒之前，首先要對圖像質量進行初步評估，最少要保證有 30 ~50 張圖像可以使用。盡管低分辨率的重構對散光和漂移的要求并不是很高，但為了避免假象出現，還應該盡量選擇高質量的圖像。有經驗的實驗者可以根據經驗直接選擇高質量的圖片，而客觀的評估方法可以通過檢測每張圖片的傅里葉變換參數來進行判斷。評估的第一步是觀察顆粒在圖像中的對比度。顆粒清晰并且相互分離的最好，但不可避免會出現顆粒的重疊； 顆粒不清晰和遠離焦點的圖像不能使用。（ 2）顆粒的選擇。在顆粒選擇之前，需要統一調整原始圖像平均值和標準差，并且反轉圖像的對比度。選擇顆粒方法包括手動選擇和半自動選擇。在高質量的電鏡圖片中對比度較高的顆粒至少應在1 000 ~2 000個之間。（ 3 ） 2D 分析。在 2D 分析中可以使用初始分析方法來篩選或者進一步的縮減樣本量，然后再進行顆粒的歸類平均，如果效果不好可以重新進行顆粒選擇。低分辨率的重構應該保持在2 000 ~ 3 000個顆粒，非均一的顆粒應該在5 000個。（ 4） 生成初始模型。有很多方法可以生成最初的顆粒模型，而生成初始模型的方法也存在很多爭議。各種方法都有自己的優缺點，但一個模型經過幾次細化以后，往往都能生成讓我們滿意的初始模型。如果一種方法并不能得到初始模型，有可能是由于蛋白顆粒中包含不均一的結構。在這種情況下可以考慮使用其他實驗方法進行驗證。（ 5） 模型精修。初始模型生成后，基本重構已完成，但精細模型還是一個耗時較多的過程。在生成低分辨率的三維重構時，可以不進行 CTF 矯正過程，雖然會存在一定的扭曲，但并不會影響顆粒的總體結構?，F在已經有很多軟件包可以完成單顆粒三維重構過程，如EMAN,Direx,Xmipp,Relion,Frealign.
4 展望
膜蛋白作為生物蛋白中一種重要的結構蛋白，由于其所具有的重要位置，這些年已成為蛋白結構研究的重要領域。單顆粒方法和電子斷層成像是研究膜蛋白的兩種主要的方法，電子斷層成像技術與其他的結構分析技術相比，最大的優點是可以對非均質的蛋白復合物、細胞器、細胞以及鑲嵌在膜上的膜蛋白原位精細結構研究，被認為是研究原位結構的唯一方法。但電子斷層成像技術作為一個新興的學科，還處于發展和完善階段，無論在理論上還是實踐中仍有很多工作需要完成，其中自動化數據收集和處理以及提高重構分辨率是電子斷層成像兩個重要發展方向。單顆粒方法主要研究具有全同性或對稱性的蛋白結構，其通過大量的平均化可以得到高分辨率的結構蛋白。但由于蛋白脫離細胞環境，其結構和原位結構相比不可避免會發生改變。隨著冷凍斷層成像技術的不斷改善，通過這兩種方法相互結合的使用，膜蛋白的結構研究將取得一個巨大的進步。
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