蛋白質磷酸化的相關研究起步于 20 世紀初．盡管 Levene 等[1]早在 1906 年就發現卵黃素蛋白中存在磷酸基團，但直到 1932 年他們[2]才鑒定出該磷酸基團是磷酸化的絲氨酸．此后，一系列磷酸化氨基酸得到驗證，包括 9 種天然氨基酸\\(絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、賴氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸和組氨酸\\)與羥脯氨酸．磷酸化主要包含 4 種模式，即 O- 磷酸化、N- 磷酸化、S- 磷酸化和?；姿峄渲辛姿峄z氨酸、磷酸化蘇氨酸與磷酸化酪氨酸已被廣泛研究\\(圖 1\\)．它們在細胞代謝與調控中起到了重要的作用[3]．但是，其他一些磷酸化氨基酸無論從含量或者功能上都不可忽視，磷酸化組氨酸就是一個重要代表.

磷酸化組氨酸是一種廣泛存在的磷酸化氨基酸，據估計其在真核細胞內含量雖然不及磷酸化絲氨酸，卻是磷酸化酪氨酸的數十倍[4]．而且 N—P共價鍵的特異性導致磷酸化組氨酸有多種不同于O—P共價鍵連接的磷酸化絲氨酸、磷酸化蘇氨酸或磷酸化酪氨酸的化學性質．同時，蛋白質中組氨酸殘基的磷酸化也是一種調節細胞內蛋白質功能的重要方式[5]．本文將從磷酸化組氨酸的發現與發展歷史出發，總結其相關生物化學性質的研究，并進一步綜述該修飾后氨基酸生理功能的相關研究．

1發現歷史

磷酸化組氨酸最早由Severin 等[6]于1947 年實現化學合成．1963 年，Boyer 小組[7]才在線粒體蛋白質的研究中完成其生化檢驗．人們最初認識到磷酸化組氨酸可能是一個磷酸化酶的中間體狀態，而該步驟是某些酶催化過程所必需的．隨著研究的深入，人們逐漸發現磷酸化組氨酸是一種廣泛存在于生物界的信號調節方式[8]．1994年，Simon 等[9]報道了原核生物細菌中基于組氨酸磷酸化酶的“雙組分”信號傳遞系統；1993 年，報道了酵母[10]中的同源序列蛋白質SLN1 與 SSK1[11]．2000 年，Muimo研究組[12]發現，綿羊氣管上皮細胞體系中鈣離子依賴性磷酸結合蛋白 annexinⅠ存在組氨酸磷酸化現象．γ-32P 標記的 ATP 和 GTP 及相關磷酸化氨基酸生化分析證明了這一結論．這一磷酸化過程進一步導致 annexinⅠ下游的信號傳遞．因而，這個工作證明了組氨酸磷酸化在哺乳動物細胞信號傳遞過程中的重要作用．另一方面，人們也在探索磷酸化過程的逆過程，即去磷酸化過程．在細菌中，很多磷酸化酶本身也具有去磷酸化作用．Mizuno 小組[13]報道了第一個大腸桿菌中的磷酸化組氨酸去磷酸化酶SixA．該酶是 ArcB 信號通路的一個重要調節因子．此后，人們在哺乳動物細胞中也發現了許多磷酸化組氨酸去磷酸化酶[14]，而且它們具有各自不同的功能[15]．另外，其他一些氨基酸殘基的激酶也被報道利用磷酸化組氨酸作為中間體[16]．這些信號通路與某些人體生理及病理狀態直接相關，例如組蛋白上組氨酸的磷酸化與基因轉錄與表達直接相關[17],這些去磷酸化酶也因而成為潛在的藥物靶點[18]

2化學結構與命名法

人們對磷酸化組氨酸結構的研究持續了很長時間．磷酸化組氨酸在生物體內存在兩種異構體，二者的差別在于咪唑環上磷酸化的位點不同\\(圖 2\\)．這一特性與其他所有的磷酸化氨基酸都有區別．另外，人們還化學合成了 1, 3- 二磷酸化組氨酸，但是其并沒有在生物體系中被發現[19]。

值得注意的是，對于磷酸化組氨酸兩種異構體的命名一直都存在分歧．長久以來，大部分對于磷酸化組氨酸報道的文獻中都將異構體3稱為 3- 磷酸組氨酸[20]．然而，基于對于咪唑環的傳統編號命名法，也有文獻[21]將異構體3稱為 1- 磷酸組氨酸．除此之外，Delbaere 等[22]在蛋白質晶體學的研究報道中還將2和3兩個異構體分別稱作 Nδ1 位磷酸化和 Nε2 位磷酸化的組氨酸．為了避免類似的命名差異，國際純粹與應用化學聯合會\\(IUPAC\\)以及國際生化聯合會\\(IUB\\)聯合發表了關于含有磷酸基團的眾多生物分子的推薦命名法，其中便包含了這一對異構體[23]．在該命名法中，異構體2被稱為3\\(1\\)- 磷酸組氨酸，而異構體3被 稱 為 1 \\(3\\)- 磷 酸 組 氨 酸 ， 同 時 ， 詞 頭 由“phosphor”改為“phosphono”以表示離子狀態．此外，該命名法還推薦將異構體2稱為π-磷酸組氨酸或pros-磷酸組氨酸，而異構體3稱為τ-磷酸組氨酸或tele-磷酸組氨酸．

3主要生物化學性質

3.1化學不穩定性

由于磷酸化組氨酸本身的化學不穩定性，其在生物體內研究的報道相對于其他磷酸化氨基酸的報道一直較少．從熱力學角度看，磷酸化組氨酸中磷酸基團與咪唑環上的 N 原子連接形成磷酰胺結構．磷酰胺鍵本身是不夠穩定的，這是由于磷酰胺結構中的P—N 化學鍵水解過程的自由能變化\\(水解過程的標準吉布斯自由能變約為-12～-14 kcal/mol\\)較磷酸酯結構\\(磷酸化絲氨酸、磷酸化蘇氨酸、磷酸化酪氨酸\\)中的 P—O 化學鍵水解過程\\(水解過程的標準吉布斯自由能變約為-6.5～-9.5 kcal/mol\\)的自由能變化大了不少[24]．從動力學的角度看，磷酸化組氨酸對酸較為敏感，而其他通過磷酸酯連接的磷酸化氨基酸對酸較為穩定[25]．實驗表明，1 mol/L鹽酸溶液在 100℃條件下，游離的磷酸化絲氨酸、磷酸化蘇氨酸的半衰期約為 18 h，而磷酸化酪氨酸約為 5 h．1 mol/L 鹽酸溶液在 49℃條件下，游離的磷酸化組氨酸半衰期也只有數十秒．盡管兩種磷酸化組氨酸的異構體都很容易在酸性溶液中發生去磷酸化，二者的熱力學穩定性是有所區別的．π-磷酸組氨酸相比于τ-磷酸組氨酸不穩定，因此水解也就更快．而 π- 磷酸組氨酸和 τ- 磷酸組氨酸的穩定性差異被認為是N 原子上磷酸基團與質子化的α-氨基的空間距離不同所致[26]．

3.2含有磷酸化組氨酸蛋白的制備及異構體的形成與轉化

為了研究磷酸化組氨酸在蛋白質調控中的作用，我們需要首先制備含有磷酸化組氨酸的蛋白，同時也可以將此作為正對照組．方法一，最直接的方法是磷酸激酶磷酸化法．通過酶法進行磷酸化可以實現在組氨酸特定位點的選擇性磷酸化，但是只對特定酶識別的底物有效．例如酶法制備的組蛋白H4已經被廣泛地應用在生化實驗中[27]．方法二，選擇性的化學磷酸化也是一種常用的方法[28]，即利用磷酰胺鉀鹽在 pH 7～8 的條件下處理蛋白質，便可以高產率地實現組氨酸磷酸化，其他各類氨基酸殘基并不會被磷酸化．需要注意的是，在此反應中，π-磷酸組氨酸是動力學優勢的產物．而隨著反應的進行，熱力學較為穩定的τ-磷酸組氨酸會逐漸成為優勢產物．雖然通過色譜可以將兩種異構體分離，但是通過化學方法得到純凈的π-磷酸組氨酸還是一個挑戰．最近，K觟nig 小組[29]報道了利用磷酰胺基鉀\\(PPA\\)作為磷酸化試劑直接修飾天然蛋白質的工作．對于含有多個組氨酸殘基的模型蛋白，該處理法將得到一系列不同數目的組氨酸磷酸化產物．他們利用生化手段進行了表征．PPA 對所有測試的蛋白質都適用，而且還能保證其三級結構的完整性．另外，π-磷酸組氨酸即便在溫和的堿性溶液中也緩慢地轉化為τ-磷酸組氨酸[26]，這一情況同樣可能發生在分離與鑒定過程中，因而我們可以猜想從生物體內提取分離的τ-磷酸組氨酸可能有一部分由π-磷酸組氨酸轉化而來．

4磷酸化組氨酸及其相關蛋白質的研究方法

由于磷酸化組氨酸具有酸不穩定性，因此傳統的鑒定分離方法不太實用．相反，磷酸化組氨酸具有堿穩定性，即便在強堿的熱溶液中也不降解．而這樣的條件可以將磷酸化絲氨酸和磷酸化蘇氨酸等分解．這歸因于磷酰胺與磷酸酯化學性質的差別．

4.1生化技術與分析化學技術

用非特異性蛋白酶處理磷酸化蛋白可以將其降解為相應多肽片段．可以用反相薄層層析法\\(RP-TLC\\)進行鑒定，用反相電泳、反相高效液相色譜\\(RP-HPLC\\)等進行分離．質譜或者串聯質譜\\(MS/MS\\)也已廣泛用于磷酸化蛋白的分析[28]．需要特別注意的是，液相色譜的流動相如果含有酸性成分可能使其分解，而且質譜分析中的正離子檢測模式也可能使得磷酸化組氨酸脫去磷酸基團．為了克服這一技術挑戰，人們做了很多相關探索．Ross小組[30]以已知的磷酸化蛋白 HPr 為例，對樣品制備、親和分離及質譜技術進行了系統性研究．近期又有一些新的技術進展[31]．另外，由于自然條件下豐度最高的同位素31P 具有很強的核磁共振信號，因而核磁共振磷譜\\(31P NMR\\)長期被用作一種磷酸化蛋白質的分析手段[32]．自從 Gassner 等[33]于 1977年報道了首個τ-磷酸組氨酸與π-磷酸組氨酸1H與31P NMR的精細數據以來，人們已經將這一研究手段拓展到鑒定蛋白質中的磷酸化組氨酸異構體的研究中[34]．同時，人們也發展了相應的生化技術來研究直接提取含有磷酸化組氨酸的蛋白質．由于磷酸化蛋白質在體內的含量很低，首先需要對其進行富集．磷酸化蛋白質組學為此提供了具體的研究方法并取得了重要的突破[35]，人們考慮借鑒其他磷酸化氨基酸的類似研究思路用免疫親和色譜或者固定金屬親和色譜\\(IMAC\\)進行研究．例如 Napper 與其合作者[36]通過固定的銅離子\\(Ⅱ\\)親和色譜富集分離了含磷酸化組氨酸的多肽，并用 MALDI-TOF 質譜進行了研究．此外，人們還發展了帶有熒光基團或者生物素標記的分子工具用于相關研究．最近，Carlson 等[37]設計并合成了熒光基團 -ATP 類似物相連的分子\\(BODIPY-FL-ATPγS\\)．由于其可以與組氨酸激酶\\(HK\\)的 ATP 結合位點相結合，因而可以被作為一種新型策略用于二組分系統的功能研究或者抑制劑篩選．Boon 小組[38]還設計并合成了 ATP-γ-Biotin-LC-PEO- 胺分子，他們發現該分子可以作為一種生物素標記的激酶底物．該分子工具可以用于對包括組氨酸磷酸化激酶或含磷酸化組氨酸蛋白的蛋白質磷酸化研究．4.2磷酸化組氨酸類似物。

基于磷酸化組氨酸本身的不穩定性，人們考慮設計合成一些類似物進行模擬．方法一， Lasker等[39]的研究表明，含有硫代磷酸化組氨酸\\(tpHis\\)的多肽甚至在 pH 為 0 的溶液里 3 h 都保持穩定．這正是由于硫原子的電負性與吸電子能力相對于氧原子都要低一些，該類似物的酸性水解穩定性得到提高．tpHis\\(圖 3, 4\\)可以很容易地從組氨酸化學合成得到；利用組氨酸激酶可以直接將ATPγS選擇性連接到組氨酸殘基上[40]，這一酶法的制備策略早已在其他磷酸化氨基酸的類似物合成中使用過[41]．方法二，將易水解的磷酰胺鍵直接轉化為難以分解的C—P 共價鍵也是一種很自然的類似物設計法，而且也被多次用于其他磷酸化氨基酸類似物的設計中[42]．首先，人們發展了將二唑環改造為其他雜環類似物的策略，例如呋喃環\\(圖 3, 5\\)[21]、吡咯環\\(圖 3, 6\\)[43]和三唑環[44]\\(圖 3, 7, 8\\)；其次，人們還設計磷酸基團本身的類似物以實現將易水解的 P—N鍵替代為 C—N 鍵的目的，例如丙二酸酯衍生物[45]\\(圖 3, 9～12\\)．此外，Hedberg 等[46]報道了以 C—S共價鍵進一步替換 C—P 共價鍵得到的類似物\\(圖 3, 13\\)．他們將其用于 Fmoc- 固相合成中，并用合成的多肽作抑制劑對組氨酸去磷酸化酶進行結合蛋白捕獲\\(pull-down\\)實驗．特別是，這種磺酰胺類似物的氨基被認為可以模擬磷酸基團水解的過渡態．同樣利用銅離子催化的 Click 反應，Brimble 等[47]還發展了一種新型的三唑丙氨酸模擬物\\(圖 3, 14\\)，并將其用于多肽合成．

在各種磷酸化組氨酸類似物不斷設計合成的同時，對于含有翻譯后修飾蛋白質的化學全合成[48-53]與半合成[54-58]技術也在不斷發展．人們也開始研究如何制備含有這些類似物的多肽或者蛋白質．Webb 小組[59]首先將化合物8應用在 Fmoc- 固相合成中，通過脫保護得到自由的磷酸基團．此外，他們還通過理論計算證明該類似物與磷酸化組氨酸的相似性．后來，該小組[60]又進一步對磷酸基團的保護基進行了探索與篩選，并優化了此磷酸化組氨酸類似物在Fmoc- 固相合成中的應用條件．Piggott小組[61]也對氨基、羧基和磷酸基團的保護基進行了系統性的合成與比較，并將這些類似物的實用性進行了探索．發展磷酸化蛋白質的化學全合成是本領域重要研究方向之一．

4.3抗體研究

抗體在磷酸化蛋白質的生化研究中是一個必要的研究工具，而且已經發揮了重要的作用[62]．因此，人們也考慮到尋找磷酸化組氨酸的抗體，但均未成功．究其原因可能是由于磷酸化組氨酸的不穩定性導致其在血漿里迅速發生水解而無法引發足夠強度的免疫應答．此后，人們嘗試利用無法水解的類似物來誘導抗體的探索，例如含吡咯的類似物，但得到的抗體并不能正確識別原始的磷酸化組氨酸結構[43]．Marletta 及其合作者[63]用ATPγS作為組氨酸磷酸化激酶的底物，并進一步用 PNBM 處理磷酸化產物形成了半合成的磷酸化組氨酸表位，獲得了階段性的成功．但是得到的抗體也存在一定缺陷，即不能區別不同的磷酸化氨基酸\\(圖 4\\)．

值得注意的是，有些針對其他磷酸化氨基酸的抗體由于特異性不強也可以識別磷酸化組氨酸．Frackelton 研究組[64]發現，抗磷酸化酪氨酸的抗體MA-2G8 具有交叉作用，該抗體不能區分磷酸化組氨酸與磷酸化酪氨酸．直到 2010 年，Muir 小組[44]在研究磷酸化組氨酸類似物的同時研制出了磷酸化組氨酸的抗體蛋白．他們用組蛋白 H4 的 18 位組氨酸磷酸化誘導產生了特異性抗體，這一策略對其他磷酸化蛋白質抗體的研制可能同樣適用．此后，Muir 等[65]又得到了第一個不具有序列依賴性的磷酸化組氨酸特異性抗體\\(pan-pHis 抗體\\)．他們利用τ-磷酸組氨酸的水解穩定類似物\\(pTze\\)作為半抗原誘導產生抗體．該抗體已經被成功應用于 ELISA、Western免疫印跡、斑點雜交\\(Dot blot\\)測試和免疫沉淀等各類生化實驗．他們進一步在細胞裂解液中借助MS 檢測鑒定出了一系列含有磷酸化組氨酸的蛋白質，并得到一系列相關生物學發現．

5主要生理功能

由于含磷酸化組氨酸的蛋白質在生物體中起到了重要的調節作用，人們對其生物學功能做了系統性的研究．目前發現的與組氨酸磷酸化相關的蛋白主要包括 4 類[66]．a．磷酸化組氨酸作為酶的中間產物參與到磷酸基團向小分子的轉運過程，包括核苷二磷酸激酶\\(NDPK\\)、ATP- 檸檬酸裂解酶等．b．能夠被組氨酸磷酸激酶磷酸化的蛋白質，例如膜聯蛋白Ⅰ、ATP- 檸檬酸水解酶、異質化的三聚化G 蛋白等．c．具有組氨酸激酶活性的蛋白質，包括二組分信號通路中的組氨酸激酶、NDPK 與組蛋白H4 組氨酸激酶等．d．磷酸酶，包括磷酸化組氨酸磷酸酶以及各種蛋白磷酸酶．組氨酸磷酸化參與到細菌、真菌、植物中的兩組分和多組分磷酸轉移信號通路．原核生物中比較典型的磷酸化組氨酸系統包括糖磷酸轉移酶系統、細菌二組分系統以及一些其他受酶催化的過程，例如二磷酸核苷激酶和輔酶 A 合成酶等[22]．而在高等真核動物信號傳導過程中，磷酸化組氨酸對胰島素分泌過程起到的重要調控作用，下面將重點介紹.

5.1磷酸化組氨酸在原核生物中的生理作用

5.1.1磷酸化丙酮酸 - 糖磷酸轉移酶系統\\(PTS\\)．原核生物中很多體系都涉及到磷酸化組氨酸，包括新陳代謝、物質轉運等[67]．其中磷酸化丙酮酸 - 糖磷酸轉移酶系統\\(PTS\\)介導了糖類以磷酸化的形式穿過細胞膜的過程，而且已經有較為詳細的研究[22]．糖的磷酸化包含四個連續的磷酸基團轉移步驟，而糖穿過細菌細胞膜的轉運過程也與該過程同步發生．此過程主要涉及酶Ⅰ和酶Ⅱ兩類磷酸化酶．在這一過程中，酶Ⅰ\\(EI\\)以磷酸烯醇式丙酮酸\\(PEP\\)為底物首先主動磷酸化，然后將磷酸基團轉移到含組氨酸的蛋白\\(HPr\\)上．酶Ⅱ是一類含有多個結構域的酶類或者獨立的蛋白質，分為 EⅡA和 EⅡB 等多類．其中，EⅡA 催化該含組氨酸蛋白上的磷?；D移到 EⅡB．糖類分子被糖特異性 -EⅡB 催化磷酸化，并由膜結合的 EⅡC 介導穿過細胞膜\\(圖 5\\)．值得注意的是，除了 EⅡB 類酶是半胱氨酸側鏈巰基磷酸化外，PTS 中其他酶類都是組氨酸殘基磷酸化．NMR 研究進一步表明，π-磷酸組氨酸與τ-磷酸組氨酸都存在于本過程中：

E1 與 EⅡA 酶所含的組氨酸為 τ- 磷酸化，而 HPr所含的組氨酸為π-磷酸化．這也意味著磷酸基團在兩種組分間的相互轉化．然而，PTS 相關蛋白質磷酸化形式的蛋白質晶體結構還沒有報道過[68]．此外，Suh 小組[69]用電脈沖法研究了 EⅠ與 HPr 兩個磷酸酶之間的磷酸基團轉移過程，并在毫秒尺度上揭示了磷酸化反應的動力學特性．不僅原核細胞內有磷酸化調控體系，人溶質轉運蛋白 SLC37 家族在糖轉運過程中也有類似的磷酸化調控機制[70]．該糖 - 磷酸基團交換體系含有A1～A4四種固定于內質網膜的蛋白質．這些蛋白質通過多步磷酸化過程，最終實現將葡萄糖以葡萄糖 -6- 磷酸的形式轉運出膜．

5.1.2二組分系統

磷酸化組氨酸在二組分系統中也發揮重要調節作用，而這樣的二組分系統本身廣泛存在于真細菌、古細菌和真核生物中．這些二組分信號傳遞系統與細胞外 pH、溫度、趨化因子、滲透壓的變化等刺激因素相耦合，觸發細胞功能、生長、分化和運動狀態的改變，從而起到感受器的作用[68]．二組分系統中較為保守的組成成分包括組氨酸激酶和一個起到響應作用的調控蛋白．以細菌趨化性感受系統為例，組氨酸激酶 CheA 折疊形成三個結構域，即刺激感受域、二聚化功能域與激酶功能域．刺激感受域含有兩個跨膜組分，用以感受外界刺激；二聚化功能域的功能是形成同源二聚體；激酶功能域可以以 ATP 為底物催化該同源二聚體中兩個單體間發生相互磷酸化．因此，二聚化功能域是激酶實現功能所必需的．值得注意的是，該過程涉及到的是組氨酸的τ-磷酸化[71]．起響應作用的調控蛋白作為二元體系的另一組分，含有調節域\\(regulator\\)與效應域\\(effector\\)兩部分．磷酸基團將從二聚功能域的組氨酸殘基上轉移到調控蛋白的調節域天冬氨酸殘基上，通過蛋白質 - 蛋白質相互作用使效應域發生構象變化，并激活效應域傳遞信號到下游\\(圖 6\\)[72]．這類系統的存在使得生物體能夠敏銳地感知外界環境變化．

5.2磷酸化組氨酸在哺乳動物中的生理作用

磷酸化組氨酸在哺乳動物細胞中也發揮了多種作用．人們在哺乳動物細胞中發現了若干組氨酸激酶，其中典型的包括二磷酸腺苷酸激酶\\(NDPK\\)、琥珀酰輔酶 A 合成酶\\(SCS\\)、組蛋白 H4 組氨酸激酶和人類線粒體二組分組氨酸激酶類等．同時，仍有報道新的磷酸化組氨酸相關蛋白，例如 Zhu 等[73]于 2012 年報道了首個脊椎動物的組氨酸去磷酸化酶 PHP14．該 14 ku 的蛋白在肝癌、肺癌細胞的增殖中有重要作用．組蛋白上組氨酸去磷酸化酶也對于肝臟的再生與癌變密切相關[74]．磷酸化組氨酸在胰島細胞中的信號傳遞相關的作用已經研究得較為清楚．已有報道的相關調控作用包括參與 GTP 代謝、參與胰島細胞內生性的 G 蛋白調控\\(且該 G 蛋白參與葡萄糖誘導胰島素分泌過程\\(GSIS\\)\\)、調節線粒體代謝酶系、調節如類異戊二烯在內的其他細胞內代謝過程[68]等．

5.2.1獨立于線粒體氧化呼吸的 GTP 合成．許多工作表明GTP 在小鼠及人胰島素的生理性分泌過程中起到重要作用[75]．Pintar小組[76]在小鼠胰島細胞中進行相關研究，首次證明了GTP 對于胰島素的分泌是必要的，而且還可能是該過程的限速步驟．但是胰島細胞中二磷酸核糖核苷酸\\(NDP\\)向三磷酸核糖核苷酸\\(NTP\\)的轉化機制尚不清楚，而后者才是該過程中起直接作用的嘌呤核苷酸的存在形式．盡管電子轉移鏈理論上可以以GDP 作為受體來實現底物水平磷酸化，但 GDP 并不是線粒體核酸轉移酶的受體．因而 GTP 的形成過程無法與線粒體中的氧化磷酸化過程相耦聯．另一方面，Srere 等[77]報道，NDPK 可能具有將線粒體中的反應與胞內反應相耦聯的作用，而這些細胞內反應大多是胰島素分泌所必需的．后續研究表明，NDPK 可能對維持 GTP/GDP 的比例起到關鍵調節作用，從而進一步調節 G 蛋白功能[78]．這一過程的具體步驟可能是 NDPK 將線粒體產生的 ATP的末端磷酸基團直接轉移到胞內的 GDP 上，因而對 GTP/GDP 比例變化起到了“緩沖”作用．這種高比例的 GTP/GDP 對于維持胰島素分泌可能比GTP 的絕對量更為重要[79]．

5.2.2調節胰島細胞內部 G 蛋白

在調控 GTP 水平的基礎上，磷酸化組氨酸進而能夠起到對胰島細胞中 G 蛋白的調節作用[80]．此作用范圍較為廣泛，包括三聚化的大 G 蛋白和單體小 G 蛋白．通過對 G 蛋白的調節，磷酸化組氨酸相關蛋白可以進而實現對胰島素分泌的調節[81]．

a．對小 G 蛋白功能的調節．眾多研究表明，nm23-H 家族基因所表達的NDPK/NM23 家族蛋白對小 G 蛋白及其相關信號通路有重要調控作用，而 NDPK 本身即受到組氨酸磷酸化的調控．Gallagher 及其合作者[82]以 NIH-3T3細胞株為研究對象，發現其中 NDPK 對 Rac 蛋白相關的皮層活動過程以及GTP依賴的胞內囊泡運輸過程都起到調節作用．該研究還表明，這些效應并不是由囊泡定位的 NDP 激酶的作用所導致的．研究顯示，在 GTP 酶突變的條件下，高濃度的GTP會使這些小 G 蛋白保持與 GTP 的結合作用而持續激活．Fischbach 等[83]則報道了 NDPK 使得原癌基因 Ras 蛋白失活的作用．這意味著 NDPK 具有類似 GTP 酶的性質．另一方面，NM23 家族蛋白激酶對細胞的調控作用早在 1999 年就為 Kahn小組[84]所報道．該小組[85]首先報道了一個 35 ku 的蛋白質并命名為 Rad\\(Ras 相關糖尿病蛋白\\)．接下來，他們系統性地研究了 NM23 蛋白與 Rad 的作用．研究發現，NM23 既能促進 Rad 與 GTP 結合，也能促進Rad-GTP 向 Rad-GDP 的轉化．他們揭示了這種雙向雙分子調節機制．由于 Rad 對葡萄糖攝取具有調控作用[86]，NM23 也因此與某些種類的糖尿病相關．綜合以上結果，nm23/NDPK 的信號傳遞作用對調節小 G 蛋白起著重要的作用．

b．對三聚化 G 蛋白功能的調控

除了對單聚的小G 蛋白的作用外，磷酸化組氨酸對三聚體的 G 蛋白也有間接的調節作用．Piacentini等[87]早在 1996 年就報道了磷酸基團的轉移在大 G 蛋白激活過程中起到的作用；后來，Hippe等[88]提出了假想的 NDPK B 與 Gα 亞基的復合體 3D 結構．同時，他們提出了 NDPK/NM23 類酶對三聚化G 蛋白的激活存在的兩種可能機制．第一種，NDPK 利用 ATP 將 G 蛋白附近的 GDP 三磷酸化得到 GTP，GTP 轉移到 Gα 亞基上完成GTP/ GDP 轉換．第二種機制則明顯不同，在胞內ATP 存在下， NDPK/NM23 將 G 蛋白亞基上的GDP 轉磷酸化形成 GTP．相比而言，第一種理論得到的認可度較高．此外，Wieland 等[89]的早期研究表明，HL-60 細胞中 G 蛋白的 β 亞基存在一個依賴GTP 的磷酸化過程，后續研究證明對 G 蛋白功能起關鍵作用的正是這一 G 蛋白 β 亞基的組氨酸磷酸化．在此基礎上，Klinker 等[90]對 NDPK 在對視網膜 G 蛋白這一轉導蛋白的激活過程所發揮的作用進行了進一步研究，而這一過程也就是通過組氨酸磷酸化實現的．他們在可溶的轉導蛋白提取液中檢測到明顯的 NDPK 活性，這一活性物質被認為是轉導蛋白 -NDPK 復合體．這一轉導蛋白 -NDPK 復合體表現出對 GDP 作為磷酸基團受體的偏好性．基于以上現象，他們認為水溶液制備的轉導蛋白中含有對于 GDP 敏感的 NDPK．同時，轉導蛋白的β亞基在促進三聚化 G 蛋白的激活過程中起到了作為磷酸化的 NDPK 中間體的作用．Cuello 等[91]報道了一個最為直接的證據：三聚化 G蛋白的激活是通過一個高能磷酸基團從 NDPK 的磷酸化組氨酸轉移到三聚化 G 蛋白 β 亞基而實現的．Hippe 等[92]在 H10 細胞中也有類似發現，他們的研究證明了 NDPK 與 G 蛋白 βγ 復合物之間的相互聯系．綜合這些研究結果可知，NDPK 對三聚化G 蛋白的確存在激活作用．基于這些發現，研究者們[88]還最終提出了依賴受體的三聚化 G 蛋白激活機制．

5.2.3其他調節機制

除了以上幾種重要的調節機制外，磷酸化組氨酸對真核生物其他的一些代謝過程也有重要調節作用．

a．磷酸化組氨酸對線粒體一些中間代謝過程酶系的激活起到調控作用，包括ATP- 檸檬酸水解酶\\(ACL\\)、琥珀酰輔酶 A 合成酶\\(SCS\\)等．ACL 承擔著為神經組織合成乙酰膽堿提供乙酰CoA 的任務．Fan 小組[93]利用多種生化手段詳細地研究了人ACL的活性位點\\(例如 760 位組蛋白\\)、催化機制及動力學特點．ACL 是人蛋白質組氨酸去磷酸化酶\\(PHP\\)的一個已知底物，故而 PHP 對神經系統的調節一直被廣泛關注[94]．同時，PHP 可以被血管壁等組織細胞所表達產生，Krieglstein 及其合作者[95]研究了PHP 的過表達或下調對血管內皮細胞的存活情況的影響．此外，SCS 也是該領域的研究重點之一．包括 Steeg 等[96]與 Shulman 等[97]的一系列重要研究證明，SCS 和線粒體 NDPK\\(mNDPK\\)[98]與胰島素分泌細胞存在潛在聯系．這些研究都顯示了線粒體中磷酸化組氨酸對胰島素分泌過程可能起到的重要調控作用．最近研究表明，心臟細胞線粒體中也同樣存在基質和氧化呼吸蛋白復合體的磷酸化調控[99]．

b．磷酸化組氨酸對離子通道也有相應的調控作用．Srivastava 等[100]于 2006 年首先報道 NDPK對鈣離子激活的鉀離子通道 KCa3.1 的調控作用．他們發現 KCa3.1 與 NDPK-B 結合后能使其本身的組氨酸殘基磷酸化，進而激活該鉀離子通道．這一作用在多種細胞中都能調控鈣離子內流．該研究同時發現了 T 細胞活化所必需的一個新的通路，對本領域發展有奠基性作用．

c．磷酸化組氨酸對類異戊二烯代謝的調控作用．研究表明大部分小 G 蛋白和三聚化 G 蛋白的亞基都會在其 C 端半胱氨酸側鏈上進行翻譯后修飾，這一修飾基團對于其與對應的效應蛋白或者磷脂膜對應位點的相互作用是必需的[101]．研究人員利用基因手段或者位點特異性的蛋白法尼基化\\(Farnesylation\\)和香葉基化\\(Geranylation\\)抑制劑，證明類異戊二烯衍生的蛋白質修飾模式對 GSIS 是至關重要的．這些發現也在 INS 832/13 細胞中通過分子生物學及生物化學手段得以證實[102]。

6結論與展望

在經歷了一系列的探索后，人們對磷酸化這一蛋白質調控機制有了更加深入的認識．磷酸化組氨酸是三種含有 N—P 共價鍵的磷酸化氨基酸之一．作為一種較為特殊的磷酸化形式，它對于人們認識蛋白質的磷酸化調節機制有促進作用．由于該磷酸化形式不同于其他磷酸化氨基酸的化學性質，人們需要針對含有磷酸化組氨酸的蛋白質發展全新的制備、分離與表征策略[103]．本文綜述了相關化學技術的發展和目前對于磷酸化組氨酸生物功能的研究情況．目前，由于磷酸化組氨酸具有化學不穩定性，因而制備含有天然結構磷酸化組氨酸的蛋白質是當前一個重要的科學問題．為了解決這一問題，人們發展了各種類似物作為磷酸化組氨酸的替代品．因此，如何將磷酸化組氨酸及其類似物引入待研究的蛋白質中就成為了當前工作的挑戰．目前，可用來解決該難題的策略主要包括蛋白質化學合成及非天然氨基酸定點嵌入兩種途徑．迄今為止，人們利用Fmoc- 固相合成法已得到了若干含有磷酸化組氨酸類似物的多肽，而相應全長蛋白或完整結構域的全合成工作還未有報道，這可能是今后研究的重點之一．另外，非天然氨基酸定點嵌入的策略也是獲得含有非天然氨基酸蛋白質的重要技術[104-105]．該技術近期已有較為迅速的發展，成功地將一系列非天然氨基酸定點引入了目標蛋白，并進一步完成了對其功能的研究[55, 106-111]．因此，能否利用此技術將磷酸化組氨酸類似物定點引入目標蛋白也將成為下一步研究的重點．其次，調控磷酸化組氨酸相關代謝通路的發現與機理研究也是磷酸化組氨酸生物學功能研究的重點之一．將新發展的抗體作為分子生物學工具[70]可能發現更多的新組分與新機制．

參 考 文 獻

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[2] Lipmann F A, Levene P A. Serinephosphoric acid obtained onhydrolysis of vitellinic acid. J Biol Chem, 1932, 98\\(1\\): 109-114

[3] Pawson T. Specificity in signal transduction: from phosphotyrosine-SH2 domain interactions to complex cellular systems. Cell, 2004,116\\(2\\): 191-203

[4] Matthews H R. Protein kinases and phosphatases that act onhistidine, lysine, or arginine residues in eukaryotic proteins-apossible regulator of the mitogen-activated protein kinase cascade.Pharmacology & Therapeutics, 1995, 67\\(3\\): 323-350