1990 年，Ellington 等[1]和 Tuerk 等[2]創建了一種能制備高特異性、高親和力結合靶分子的寡核苷酸技術，稱為指數富集的配體系統進化（systematicevolution of ligands by exponential enrichment,SELEX）技術。用這種技術制備的寡核苷酸分子稱為適體（aptamer），一般由幾十個核苷酸組成，可以是 RNA或單鏈 DNA.理論上幾乎所有自然界中存在的靶分子均可通過 SELEX 技術篩選得到相應的適體。20多年來，核酸適體作為新型的仿生識別元素，在疾病診斷治療、藥物篩選、分子識別、分析檢測等眾多領域得到了廣泛的應用，國內外眾多科學工作者通過SELEX 技術篩選得到了多種靶分子的適體，核酸適體篩選技術本身也得到了不斷地完善和發展。

1 SELEX 技術的原理及流程

SELEX 技術是體外篩選核酸適體的基本方法，是一種以組合化學技術、PCR 技術以及基因克隆測序技術等為基礎的現代分子進化工程技術，該技術的操作流程類似于達爾文的生物進化論中所包含的3 個過程：自發突變、自然選擇和大量增殖[3].采用SELEX 技術篩選適體包括以下幾個基本步驟：①人工合成隨機的寡核苷酸序列文庫，文庫的容量一般在 1014~ 1018之間，文庫中隨機寡核苷酸序列一般為20 ~ 60 個堿基文庫；②在特定的篩選緩沖體系中將寡核苷酸庫與靶分子孵育；③用離心法、柱層析法、膜過濾法、毛細管電泳法、磁珠法等特定的方法，將與靶分子結合的寡核苷酸序列從體系中分離；④對分離的特異性結合的核酸序列進行 PCR 擴增；⑤將PCR 擴增獲得雙鏈 DNA 利用磁珠法、核酸外切酶法、變性高效液相色譜法拆分獲得次級的寡核苷酸庫；⑥重復② ~ ⑤步，隨著篩選輪數的不斷增加，文庫里親和力低的寡核苷酸序列被逐漸淘汰，對最終篩選到的寡核苷酸序列進行克隆測序，并對寡核苷酸序列與相應的靶分子結合的特異性和親和力進行鑒定和檢測[4].

2 核酸適體的篩選方法

將分子進化的過程在體外進行是 SELEX 技術最大的特點，但在適體篩選的實際過程中，往往會受到篩選環境以及 SELEX 技術本身的限制，影響到篩選效率和效果。近年來，在傳統 SELEX 技術的基礎上，新的 SELEX 技術不斷涌現，這些新的技術在不斷完善 SELEX 技術的同時，也極大地推動了適體技術在生物醫學、藥物篩選、靶向治療、農藥檢測[5]、環境監測、食品安全等領域中的發展和應用。

2. 1 毛細 管電泳 SELEX（capillary electrophoresisSELEX,CE-SELEX）技術

如何將與靶分子結合的寡核苷酸從體系中分離出來，是限制傳統 SELEX技術發展的一個瓶頸。2004 年，Mendonsa 等[6]根據核酸適體與靶分子結合后使靶分子原有的質量和構象發生改變并導致其電泳行為變化的特性，運用毛細管電泳技術將靶分子結合的核酸與游離的核酸進行了有效的分離。2005 年，Drabovich 等[7]利用CE-SELEX 技術，僅用 3 輪篩選就獲得了能特異性結合 Muts 蛋白的適體。Tang 等[8]對毛細管電泳法與親和層析法篩選蓖麻毒素的適體的結果進行比較，親和層析法在第 9 輪篩選后結合率僅為 38. 5%,而毛細管電泳法在第 2 輪篩選后結合率已達 60. 2%,經過 4 輪篩選后結合率高達 87. 2%,整個實驗在 2周之內完成。CE-SELEX 技術最大的優點就是顯著提高了篩選效率，一般僅需 2 ~ 4 輪篩選即可獲得所需適體[4].利用毛細管電泳的微量流體技術使得篩選效率大大提高，尤其適用于常規篩選不易獲得的極少量靶物質的適體[9].徐華等[10]以表達有綠色熒光蛋白的 HepG2 細胞作為靶細胞，利用 CE-SELEX技術僅經過 1 輪篩選就獲得了較好的效果。Krylov等[11]將動力學方法與毛細管電泳結合，創建了平衡混合物非平衡毛細管電泳（non-equilibrium capillaryelectrophoresis of equilibrium mixtures,NECEEM）技術。Berezovski 等[12]利用 NECEEM 技術，僅用了 1輪篩選就獲得了親和力為 1 nmol / L 的法呢基轉移酶（farnesyltransferase,FTase）適體。Yang 等[13]利用CE-SELEX 技術，僅用了 3 輪篩選就獲得了 NMM（N-methyl mesoporphyrin）的適體。Tran 等[14]利用這種方法，經過 8 輪篩選成功獲得了花生過敏原之一的阿糖胞苷 H1 的適體。CE-SELEX 技術的主要缺陷是進樣體積?。╪L 級），文庫中 DNA 分子的數量一般只有 1013個[4].

2. 2 熒光磁珠 SELEX（FluMag SELEX）技術

2005年，Stoltenburg 等[15]引入熒光標記和磁珠分離技術篩選了鏈霉親和素的適體，建立了 FluMag SELEX技術。他們首先將鏈酶親和素包被在磁珠上，然后與文庫孵育，將未與靶分子結合的核酸分離除去，對洗脫下來的目標核酸用熒光標記的引物進行 PCR 擴增，最后采用聚丙烯酰胺凝膠電泳，回收正義鏈生成次級文庫進入下一輪篩選。同年，Mann 等[16]

利用該方法成功篩選到了乙醇胺的核酸適體。2010 年，Kim 等[17]用 FluMag SELEX 技術成功篩選到了布洛芬的適體，結果表明，所得適體對于布洛芬具有較高的特異性，而對于結構相似的布洛芬類似物（非諾洛芬、氟比洛芬和萘普生）和土霉素則未表現出任何的親和力。2012 年，Xu 等[18]

用同樣的方法篩選到了3,3′，4,4′-四氯聯苯（PCB77）的適體，成為環境快速監測的潛在工具。該方法操作簡單，篩選快速高效，所需靶分子量少，且節約成本，利用熒光來定量從而避免了同位素的使用，可以對與靶分子結合的核酸量進行定量監控分析。

2. 3 自動化 SELEX（automated SELEX）技術

1998年，Cox 等[19]在 Beckmann Biomek 2000 Pipetting 系統的基礎上創建了自動化篩選工作站，首先通過鏈酶親和素與生物素之間的作用，將被生物素標記的靶分子固定在磁珠上；然后將與靶分子結合的寡核苷酸序列從體系中分離出來，RT-PCR 擴增和轉錄則通過已設定的程序自動完成；經 12 輪篩選成功獲得了溶菌酶的適體，整個篩選過程僅用了不到 2 d 的時間。2005 年，Eulberg 等[20]在此基礎上創建了半自動化篩選平臺，并成功篩選出了 P 物質的適體。該篩選平臺將超濾設備、熒光檢測器和半定量 PCR 儀等設備整合到一起，實現了對與靶分子結合的寡核苷酸量的在線監控，同時也能滿足在不同的緩沖溶液以及其他嚴格的篩選要求。2006 年，Hybarger等[21]創建了由 PCR 儀與 Labview 控制的活動瓣膜組成的微流 SELEX 樣機，將操作轉移到芯片微流環境中進行，具有提高篩選速度和降低成本等優勢。

2. 4 細胞-SELEX（cell-SELEX） 技術

cell-SELEX技術是指使用完整的細胞與核酸文庫直接作用，從而篩選出能與細胞表面分子特異性結合的適體的技術。目前，采用該技術篩選到的一些適體已被用于疾病診斷和實驗性的臨床治療中。Ara 等[22]采用cell-SELEX 技術成功篩選到了腫瘤細胞表面抗原的適體，從而避免了對抗原的純化過程，同時保持了細胞表面抗原的天然構象，這對于腫瘤的診斷和治療具有重要意義。張興梅等[23]

利用人工合成的 KLH-C18 作為靶標，用微孔板法進行 SELEX 篩選，完成了 7 輪篩選后，對最終篩選到的寡核苷酸序列進行克隆測序，選取適體 C6 進行結合 ELISA 的測定，并與轉染 prominin-1 質粒的 U87 細胞免疫組化，用鏈酶親和素磁珠進行適體 C6 的免疫共沉淀，經過 7 輪篩選得到了具有特定二級結構的適體，適體 C6 能與C18 肽和表達人 prominin-1 的 U87 細胞結合，pulldown 試驗結果顯示，C6 能識別天然狀態下的 pro-minin-1 蛋白，為腫瘤的診斷與治療奠定了基礎。郭鵬等[24]運用 cell-SELEX 技術，經過 12 輪篩選最終獲得了親和性高、特異性強的胃腺癌早期原代細胞的適體，為胃腺癌的早期診斷和藥物靶向治療奠定了基礎。2011 年，Li 等[25]用該方法經過 11 輪篩選，獲得了大腸埃希菌 K88 的適體，該適體有望成為大腸埃希菌快速檢測的潛在工具；次年，Liu 等[26]用同樣的方法經過 11 輪篩選，成功獲得了沙門氏菌 O8的適體。2013 年，Duan 等[27]利用 cell-SELEX 技術經過 8 輪篩選，獲得了李斯特菌的適體，成為快速篩查和檢測食源性疾病的潛在工具。Graham 等[28]則利用 cell-SELEX 技術篩選到了宮頸癌細胞的適體，可用作確定宮頸癌新的生物標志物。Ji 等[29]通過刺激-反應兩步法的細胞 SELEX（stimulus-response cell-SELEX,SRC-SELEX）技術成功篩選到了動脈粥樣硬化斑塊組織發炎的內皮細胞的適體，該方法簡化了cell-SELEX 技術繁瑣和耗時的步驟。Chen 等[30]

利用活細胞表面 SELEX（cell surface SELEX,CS-SELEX）技術，經過 13 輪篩選，成功獲得了能與丙型肝炎病毒包膜表面糖蛋白 E2 特異性結合的適體，為肝炎的早期診斷與治療提供了新的思路。

2. 5 消減SELEX（subtractiveSELEX）技術

subtractiveSELEX 技術的基本原理就是在篩選的過程中將能與已知或未知的共有靶分子結合的寡核苷酸從文庫里去除，再將消減之后的次級文庫投入到篩選的過程中。消減目的是進一步提高適體的特異性，減弱靶分子類似物的干擾，利用 subtractive SELEX 技術能從高度同源的靶分子中篩選到差異靶分子的適體，從而使得該技術在臨床診斷和靶向治療以及腫瘤的個性化治療方面具有獨特優勢。陳樺等[31]以小鼠 IgG 亞類作為靶分子，采用靶標替換消減 SELEX的方法進行了 16 輪篩選，獲得了能與小鼠 IgG 不同亞類相同部位 Fc 片段特異性結合的適體，為小鼠抗體親和層析以及不同分子的相同部位的作用機制的研究奠定了基礎。汪江波等[32]以 EP 管為篩選介質，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistantStaphylococcus aureus,MRSA）為正篩靶標，甲氧西林敏感葡萄球菌（methicillin-sensitive Staphylococcus au-reus,MSSA）為反篩靶標，經過 20 輪篩選，成功篩選到了 MRSA 的適體，其中 AM6 能特異性結合 MRSA,這為以 AM6 作為靶向劑的新型的 MRSA 診斷與靶向治療藥物的開發奠定了基礎。2012 年，Lee 等[33]通過 subtractive SELEX 技術，經 6 輪篩選獲得了大腸埃希菌 O157:H7 的適體。2013 年，Wang 等[34]利用 subtractive SELEX 技術，經 9 輪篩選獲得了高致齲變形鏈球菌菌株的適體。

2. 6 加尾 SELEX（tailored SELEX）技術

人工合成的寡核苷酸序列通常包含中間的隨機區和兩端的固定區，雖然固定區方便了 PCR 擴增和體外轉錄，但往往會參與適體與靶分子的結合，從而對后續的截短活性序列造成影響，固定區還可能由于參與隨機區的退火而影響篩選[4].2003 年，Vater 等[35]創建了tailored SELEX 技術，利用該技術成功篩選出了能高親和力結合降鈣素基因相關肽 1（calcitonin gene-re-lated peptide 1,Ca-CGRP1）的適體。他們在隨機文庫兩端增加了較短的固定序列，以此與接頭序列形成搭橋，PCR 擴增時引物與篩選庫通過搭橋連接，擴增后引物被裂解，下一輪循環的寡核苷酸仍含有較短的固定序列。tailored SELEX 技術的兩個額外步驟是引入連接接頭片段和裂解 PCR 產物。用該技術篩選獲得的適體不含兩端引物結合部位，無需進行截短處理便可得到只含隨機區的適體，從而解決了常規SELEX 技術篩選后續截短處理所帶來的問題。

2. 7 結合定量 PCR 的 SELEX 技術

該方法將適體的特異性與定量 PCR 的放大性相結合，從而有助于篩選到高親和力的適體，同時也大大提高了對靶物質的檢測水平[9].Avci-Adali 等[36]將定量 PCR 技術運用到 cell-SELEX 技術中，成功篩選到了高親和力的適體。Liang 等[37]用該方法篩選到了抗狂犬病毒感染的活細胞的適體，有望成為治療狂犬病的潛在工具。由于定量 PCR 技術具有高度的靈敏性，為了保證特異性，嚴格控制 PCR 的條件、充分洗滌、嚴格對照等是必要的。

2. 8 結合流式細胞的 SELEX 技術

篩選過程中對核酸文庫進行熒光標記與細胞作用，用流式技術完成分離后，再進行次一級的 PCR 擴增篩選，從而提高了對適體的篩選速率。陳文學等[38]

以人類皰疹病毒第四型（Epstein-Barr virus,EB）陽性低分化的鼻咽癌細胞為正篩靶標，正常鼻咽上皮細胞為反篩靶標，采用流式細胞儀檢測核酸文庫的特異性和親和力，經過 10 輪篩選，文庫與靶細胞的結合力隨著篩選輪數的增加而加強，初步建立了 EB 病毒陽性鼻咽癌細胞適體文庫，為鼻咽癌的診斷和治療奠定了基礎。

此外，還有切換 SELEX[39]、表達盒 SELEX[40]、無引物基因組 SELEX[41]、復合靶解析 SELEX[42]、非SELEX[43]、變構 SELEX[44]、磁珠 SELEX[45-47]、捕獲SELEX[48 ]、微孔板 SELEX[23 ]、RNA 適體隔離 SE-LEX[49]技術等。

3 展 望

SELEX 技術自出現以來，就得到了不斷的豐富與完善，核酸適體的應用范圍也越來越廣，尤其在生物醫學、藥物篩選和靶向治療等研究領域，具有極大的應用價值。對于一些小分子物質很難得到相應的抗體，而適體的獲得相對容易，因此，適體技術也可用于農藥檢測、環境監測、食品安全等領域。目前SELEX 技術的發展非常迅速，但要篩選到可供現實使用的適體依然面臨一些困難，適體的特異性仍存在問題。如何快速篩選出特異性高、親和性強的適體，仍是科研工作者們未來的研究方向。