端粒酶（ Telomerase） 作為一種核糖核蛋白，其主要功能是催化端粒（ Telomere） 末端不斷延伸（ TTAGGG）n序列，從而克服細胞分裂過程中的端?？s短問題，維持端粒的適當長度與穩定性。 盡管端粒酶在抗衰老研究中具有良好的前景，但它也是導致腫瘤細胞無限分裂的重要因素。 研究表明，端粒酶在 85%以上的人類腫瘤細胞中被高表達，而在正常體細胞中的表達量則極低甚至不表達[1]. 因此，端粒酶也被認為是最具通用性的癌癥診斷與治療的標志物之一，受到日益廣泛的關注。

近年來，基于光譜、電化學以及納米技術的各種端粒酶檢測新方法不斷涌現[2,3]. 但迄今最常用的仍是基于聚合酶鏈式反應（ PCR） 的端粒重復序列擴增（ Telomeric repeat amplification protocol,TRAP） 方法[4]. 這主要是因為端粒酶的含量非常低，即使在腫瘤細胞中也只有 50 個分子左右[5],因此提高檢測的靈敏度始終是該研究領域必須面對的挑戰之一。 盡管 TRAP 方法十分有效，可以檢測低至幾個細胞甚至單個細胞內的端粒酶，但其操作過程比較復雜、費時，而且容易產生假陽性信號。 其它一些非 PCR方法，例如電致化學發光[6]、表面等離子體共振（ SPR）[7]、石英晶體微天平（ QCM）[8]、生物條碼（ BioBarcode）[9]和指數等溫擴增端粒重復序列（ EXPIATR）[10,11]等，雖然也取得了較高的靈敏度，但同樣具有體系復雜、操作繁瑣及依賴精密儀器等局限。 因此，亟需發展一種更加簡單、靈敏的端粒酶檢測新方法。

脫氧核酶（ DNAzyme） 是通過體外分子系統進化技術（ SELEX） 篩選得到的一種具有催化功能的單鏈 DNA 片段[12~14]. 由于具有催化活性高、特異性好、穩定性強、容易合成以及信號轉換機制靈活等優點，使其在生物傳感領域獲得了廣泛的應用。 2004 年，Willner 等[15]首次應用具有過氧化物酶活性的脫氧核酶實現了端粒酶檢測。 但該方法涉及多步表面修飾，操作復雜，而且容易受到細胞內端粒序列的干擾。 考慮到端粒 DNA 與脫氧核酶（ TGGGTAGGGCGGGTTGGGA） 的序列均固定不變，通過設計巧妙的探針來實現簡便的端粒酶檢測仍是一項十分艱巨的挑戰[16]. 本文研究了脫氧核酶活性的抑制與恢復方法，通過優化發卡結構設計，并結合支點介導鏈置換技術（ Toehold-mediated Strand Displacement）[17],建立了一種簡單、無標記的端粒酶檢測新方法。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

DNA 序列（ 見表 1） 均由生工生物工程（ 上海） 股份有限公司合成，采用高效液相色譜純化； 2,2'-聯氨-雙（ 3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸） 二胺鹽（ ABTS2-,純度 98%） 、氯高鐵血紅素（ Hemin,純度≥98%） 、乙二醇雙（ 2-氨基乙基醚） 四乙酸（ EGTA,純度 97%） 、苯甲基-磺酰F（ PMSF,純度 98. 5%） 和 3-[3-（ 膽酰胺丙基） 二甲氨基]-1-丙磺酸內鹽（ CHAPS,純度 98%） 均購自 Sigma-Aldrich 公司； 過氧化氫（ 質量分數≥30%） 和 Tris-HCl 緩沖溶液（ pH=7. 5） 購自 Fisher 公司； 實驗用水為過濾除菌的超純水。

1.2 實驗過程

1.2.1 細胞培養 將 Hela 細胞置于 37 ℃ 二氧化碳恒溫箱中[95%（ 體積分數） 空氣，5%CO2]培養，培養基為 RPMI 1640,含 10%（ 質量分數） 胎牛血清蛋白（ FBS） 及 100 IU/L 青霉素。 細胞數量于每次實驗前采用細胞計數板測定。

1.2.2 端粒酶的提取 采用通用的 CHAPS 方法提取端粒酶[18]. 首先采集處于指數生長期的 Hela 細胞，取 106個細胞置于 500 μL 離心管中，用 PBS 緩沖溶液洗滌 2 次； 加入 200 μL CHAPS 裂解溶液[0. 5%（ 質量分數） CHAPS + 10 mmol/L Tris-HC1（ pH = 7. 5） + 1 mmol/L MgC12+ 1 mmol / L EGTA +5 mmol / L 2-mercaptoethanol+0. 1 mmol / L PMSF+10%（ 質量分數） glycerol],并用移液器吹打直至細胞均勻分散； 將該溶液置于冰浴中孵育 30 min,再于 4 ℃下以 16000 r/min 轉速離心 20 min,然后小心收集上層清液（ 不超過 160 μL） ,并分裝于多個 50 μL 離心管中，于-80 ℃下凍存待用。

1.2.3 脫氧核酶探針的優化 將探針 TM-x（ 100 nmol / L） 與 Hemin（ 300 nmol / L） 在 HEPES 緩沖溶液[25 mmol/L HEPES（ pH=7. 8） +30 mmol/L KCl+200 mmol/L NaCl]中于室溫下孵育 10 min,加入端粒酶引物 TS（ 200 nmol/L） 或者人工合成的端粒酶延伸產物 TS-R2（ 100 或200 nmol/L） ,繼續孵育10 min;孵育結束后加入 ABTS2-（ 5 mmol/L） ,3 min 后加入過氧化氫（ 5 mmol/L） ,并開始記錄415 nm 處的吸收信號。

1.2.4 端粒酶的檢測 首先在 48 μL Tris-HCl 緩沖溶液[20 mmol / L Tris-HC1（ pH = 8. 3） + 1 mmol / LMgC12+1 mmol / L EGTA + 50 mmol / L KCl + 0. 05% （ 質量分 數 ） Tween 20]中加入端粒酶引物 TS（ 0. 8 μmol/L） ,再加入 2 μL 細胞提取液，混勻后在 30 ℃下孵育 2 h; 然后加入脫氧核酶探針 TM3-1（ 100 nmol/L） 、Hemin（ 300 nmol/L） 及 HEPES 緩沖溶液[25 mmol/L HEPES（ pH = 7. 8） +30 mmol/LKCl+200 mmol / L NaCl],繼續孵育 10 min; 孵育結束后加入 ABTS2-（ 7. 5 mmol/L） ,3 min 后加入過氧化氫（ 5 mmol/L） ,使總體積為 200 μL,并開始記錄 415 nm 處的吸收信號。

2 結果與討論

2.1 實驗原理

所建立的端粒酶檢測方法的原理如 Scheme 1 所示。 發卡型（ 頸環結構） 核酸探針（ TM-x） 由 3 部分組成： （ 1） 5‘端懸垂部分與端粒 DNA 互補； （ 2） 頸部包含引物（ TS） 的部分序列； （ 3） 環部是具有過氧化物酶活性的 DNAzyme,且也有若干個堿基被鎖于發卡頸部。 在檢測條件下，探針 TM-x 將維持穩定的發卡結構，使其不能形成 G-四鏈體（ G-Quadruplex） ,從而抑制其過氧化物酶活性。 而一旦引物 TS 被端粒酶催化延伸之后，其產物可以通過支點介導鏈置換作用[17]與探針 TM-x 的懸垂以及頸部雜交，從而破壞后者的發卡結構。 于是，被釋放出來的自由 DNAzyme 與 Hemin 結合形成具有催化活性的 G-四鏈體，進而催化過氧化氫氧化 ABTS2-,產生可被檢測的吸收信號變化。 因此，通過檢測 415 nm 處吸光度的增加值即可反映出端粒酶的催化活性。

2.2 脫氧核酶活性的抑制與恢復

由 Scheme 1 所示的檢測原理可知，該檢測方法的關鍵是探針 TM-x 中脫氧核酶活性的抑制與恢復，要保證其自身不易形成具有過氧化物酶活性的G-四鏈體結構，且不受引物 TS 的影響，又要使其易于與端粒酶延伸產物發生鏈置換反應。 為此，實驗首先考察了分別有 1~4 個 DNAzyme 堿基被鎖于“發卡頸部”的探針 TM-1~TM-4（ 見圖 1） .

如圖 2（ A） 所示，Hemin 本身催化 ABTS2-氧化的能力很弱，幾乎觀察不到吸光度的增加，而自由的 DNAzyme 則致使 415 nm 處的吸收值迅速增大，表明該 DNAzyme 具有很高的過氧化物酶活性。 與之相比，本文所設計的 4 條探針的催化活性均出現了大幅降低。 例如 TM-1,盡管只有 1 個 DNAzyme 堿基被鎖于發卡頸部，但它所引起的吸光度變化只有自由 DNAzyme 的約 1/15. 結果表明，通過限制 DNAzyme 的構象變化可以有效抑制其活性。 特別是 TM-3與 TM-4 引起的信號變化與 Hemin 相當，表明其 DNAzyme 活性幾乎完全被抑制。

比較了引物（ TS） 與端粒酶延伸產物（ TS-R2,在引物 TS 的基礎上延伸了 2 個 TTAGGG 重復序列）對于探針 TM-x 催化活性的恢復作用。 如圖 2（ B） 所示，當 TS（ 200 nmol/L） 存在時，TM-1 與 TM-2 的催化能力均顯著增強，從而導致體系的背景信號較高。 而對于 TM-4,雖然 TS 沒有使響應信號明顯增加，但 TS-R2 的恢復作用也受到了顯著影響，因而會降低檢測的靈敏度。 這主要是因為較長的頸部序列（ 10個堿基） 使得該發卡結構過于穩定，不利于 TM-4 與 TS-R2 發生鏈置換反應。 相比較而言，探針 TM-3 一方面受引物 TS 的影響較小，由其所引起的吸光度增加與 TM-3 自身的作用相當； 另一方面當 TS-R2 存在時，吸收信號顯著增強，甚至與 TM-1/TS-R2 的結果相近。 圖 2（ C） 顯示應用探針 TM-3 可以獲得最大的 RTS-R2 / TS值（ TS-R2 和 TS 所引起的信號變化的比值） . 以上結果表明，將 DNAzyme 的3 個堿基鎖于發卡探針的頸部較好地平衡了酶活性的抑制與恢復關系，使其既不受引物 TS 的影響，又易于與端粒酶延伸產物（ 如 TS-R2） 發生鏈置換反應，這將非常有利于提高檢測的靈敏度。

2.3 探針 5’端懸垂長度的影響

探針 TM-x 的 5‘端懸垂部分為端粒 DNA 的反義序列，其主要作用是作為支點（ Toehold） 促使端粒酶的延伸產物與該探針發生支點介導鏈置換反應，從而釋放被鎖于發卡結構中的 DNAzyme. 理論上，該懸垂部分越長鏈置換反應的速度越快，新生成的雙鏈結構也越穩定。 但實際上，當 Toehold 的長度超過 5 個堿基以后，鏈置換速度就不再明顯增加[17]. 另外，過長的懸垂部分還會增加探針結構的復雜性。

為此，本文比較了不同長度的端粒酶延伸產物對于 TM-3 活性的恢復作用，用以確定適合的懸垂長度。

其中，TS-02~TS-08 分別對應于在引物 TS 的基礎上延伸了 2~8 個堿基。 如圖 3（ A） 所示，TS-08 和 TS-06 對于 TM-3 活性的恢復作用基本相當，同時也與 TS-R2 的作用相似。 但隨著延伸長度的繼續縮短，其恢復 TM-3 活性的作用明顯下降，例如 TS-02 所引起的吸光度增加僅相當于 TS-08 的 1/4. 這一方面是由于有效 Toehold 長度縮短使得鏈置換反應變慢，另一方面也是因為 TS-02 與 TM-3 所形成的雙鏈不夠穩定。 由此可見，能夠有效打開 TM-3 發卡結構、恢復 DNAzyme 活性的最短序列為 TS-06,這也意味著只要引物 TS 被端粒酶延伸 1 個重復單元就能引起信號的明顯變化，從而在一定程度上提高方法的靈敏度。 根據這一結果，可以適當調整 TM-3 的5’端懸垂長度。 例如，TM-31 與 TM-32 是在 TM-3 的基礎上分別刪除了 2 個或者4 個堿基。 由圖3（ B） 可見，對于 TM-31,體系的吸光度變化與 TM-3 存在時基本相當，而對于 TM-32 則出現了較明顯的降低。 這一結果再次證明保持至少 6 個堿基的 5‘端懸垂長度非常必要，因此實驗選用 TM-31 作為較優化的探針。

2.4 Hemin 及 ABTS2-濃度的影響

在完成探針優化后，進一步考察了 Hemin 及 ABTS2-濃度對響應信號的影響。 如圖4（ A） 所示，盡管隨著 Hemin 濃度的增加，由 TS-R2 所引起的吸收值逐漸增大，但由 TS 所產生的信號也隨之增加，并且導致二者比值 RTS-R2 / TS急劇下降[圖4（ B） ]. 這主要是因為 Hemin 可以促進 DNAzyme G-四鏈體結構的形成，因此過高的濃度勢必會導致較多的發卡探針被破壞，加之 Hemin 本身也具有一定的催化能力，從而導致背景信號顯著增強。 相比較而言，由于 ABTS2-僅作為反應底物，其濃度的增加對于響應信號有積極的影響，不但吸光度值大幅度提高，而且 RTS-R2 / TS值也隨之增大[圖4（ B） ]. 但當[ABTS2-]超過7. 5mmol / L 時，該比值又開始下降。 因此，較優的 Hemin 與 ABTS2-濃度分別為0. 3 μmol/L和 7. 5 mmol/L.2.5 端粒酶的檢測在檢測端粒酶之前，先應用 TS-R2 作為端粒酶的模擬延伸產物考察了方法的靈敏度。 如圖 5（ A） 所示，利用該方法可以清晰地分辨 20 nmol/L TS-R2 與 200 nmol/L TS 所產生的吸收變化，而且隨著 TS-R2 濃度的增加，吸光度值繼續增大，并在 20 ~ 100 nmol / L 范圍內表現出良好的線性關系。 以上結果表明本方法不但具有較好的信背比，還具有較高的靈敏度（ 檢出限比 Xiao 等[16]

報道的方法低了 1 個數量級） . 圖 5（ B） 顯示了應用該方法檢測端粒酶的結果，可見它可以檢測低至 500 個 Hela 細胞等當量的端粒酶。 這一檢出限比 Pavlov 等[15,16]

所發展的方法低了近 1 倍。 另外，由于本方法不需要復雜的表面修飾，同時受細胞自身端粒 DNA 的影響較?。?TM-x 探針只能被 TS 延伸產物打開） ,因而將更適于腫瘤細胞內端粒酶的活性分析。

3 結 論

基于 DNAzyme 與支點介導鏈置換技術建立了一種端粒酶檢測新方法。 該方法簡單，不需要熒光標記和復雜的表面修飾，且靈敏度較高，有望在腫瘤細胞的端粒酶活性分析中得到廣泛應用。