1 肌球蛋白的結構與功能

肌球蛋白主要存在于平滑肌中， 它是肌原纖維粗絲的組成單位。 其分子形狀如豆芽狀，由多條重鏈與多條輕鏈組成。 肌球蛋白的家族較大，目前發現的肌球蛋白有 24 種，但依據其來源又可分為傳統的肌球蛋白和非傳統的肌球蛋白，如傳統的肌球蛋白為肌肉的肌球蛋白，即肌球蛋白Ⅱ，但非肌肉細胞也存在肌球蛋白Ⅱ， 為非肌肉肌球蛋白Ⅱ； 非傳統的肌球蛋白是指肌肉中不含有的肌球蛋白，如肌球蛋白Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ，只存在于非肌肉細胞中；肌球蛋白Ⅷ、Ⅺ和Ⅻ只存在于植物當中。此外，肌球蛋白Ⅰ在生物體內的作用是細胞運動，胞引作用和泡液收縮；骨骼肌肌球蛋白Ⅱ的作用是使骨骼肌肌肉收縮； 肌球蛋白Ⅴ主要功能是靶向小包運輸和 mRNA 的靶向運輸[1].

在生物有機界中，利用化學能/化學勢能進行機械做功的生物大分子，稱為分子馬達。 而肌球蛋白作為一種分子馬達[2],參與了肌肉收縮、趨化性胞質分裂、胞引作用、膜泡運輸以及信號傳導等活動[1].

目前研究得較多的是肌球蛋白Ⅱ， 其最早發現于動物細胞的肌肉組織和細胞質中， 形狀如“ Y”型，是一個六聚體的大分子蛋白質，包括兩條相對分子質量約為 220 kD 的重鏈、兩條約 17 kD的必須輕鏈和兩條約 20 kD 的調節性輕鏈[3]

. 根據重鏈在細胞內所起的作用， 按照結構和功能不同可劃分為 3 個區域：1）位于重鏈的 N 末端形成一個球狀的頭部，含有一個肌動蛋白（ actin） 結合位點和 ATP 結合位點的催化區域，負責釋放化學能；2）重鏈的 C 末端則形成一個細長的 α-螺旋狀的尾部， 尾部結構域含有決定尾部是同膜結合還是同其他的尾部結合的位點；3）連接頭尾的是 α-螺旋狀的頸部，其與必須輕鏈、調鈣素或類似鈣調素的調節輕鏈相連， 頸部是起到水平臂作用的區域， 在這個區域中通過 ATP 水解將產生動力沖程，實現將化學能轉化為機械能[4].

通過對各個物種的肌球蛋白重鏈， 輕鏈序列的功能結構域分別進行氨基酸水平上的多序列比對，結果發現肌球蛋白較為保守，只是個別氨基酸序列存在差異， 這表明各個物種肌球蛋白磷酸化的作用機制與功能大體一致（ 圖 1）。

2 肌球蛋白輕鏈的磷酸化由肌動蛋白-肌球蛋白（actin-myosin）相互作用介導的細胞收縮，對肌肉與非肌肉細胞的一些生理活動起著至關重要的作用，包括細胞分裂、粘連、趨化性和胞質分裂[5],其動力學活性會調控細胞收縮，調節血管滲透性，控制平滑肌細胞中的血壓[6].

2.1 肌球蛋白輕鏈磷酸化的作用機制。

肌球蛋白（ 平滑肌與非肌肉蛋白）受肌球蛋白輕鏈（ MLC）磷酸化調控[7].磷酸化的肌球蛋白是維持細胞骨架活性及細胞功能的重要效應因子[8, 9].

肌球蛋白輕鏈激酶（myosin light chain kinase, ML-CK） 和 ROCK/ROK/Rho 激 酶 （Rho kinase, ROCK）是在體內和體外使 MLC 磷酸化的兩種重要激酶[10].

通常認為， 當 Ca2+與鈣調蛋白復合體（Calmodulincomplexes,CaM）結合后，會激活 MLCK,進而 ML-CK 使 肌 球 蛋 白 輕 鏈 20 （myosin light chain 20,MLC20）上第 19 位的絲氨酸（ Ser19）磷酸化，導致激活肌球蛋白頭部的 Mg2+-ATP 酶（簡稱 ATP 酶）[11],該酶水解 ATP 產生能量會使其構象發生轉變，這種構象會使肌球蛋白去結合肌動蛋白（ actin），利用ATP 形成一種細胞收縮的壓力[12]. 相反地，用肌球蛋白輕鏈磷酸酶（ （myosin light chain phosphatase,MLCP） 使 MLC 去磷酸化后會使構象彎曲，結合肌動蛋白的能力下降。 MLCP 是一個異源三聚體蛋白，由磷酸酶（ PP1C）、肌動蛋白結合區和調節區域（ MYPT） 以及一個 20 kD 的小亞基（ ML20） 組成，但 ML20 的功能尚不清楚。MLC 的這種周期性的磷酸化與去磷酸化的狀態， 是細胞發生運動和收縮的必備條件[13].

RhoA 的 效應分子 ROCK[14]是肌球蛋白磷酸化和調節肌球蛋白功能的另一個重要調節因子，它使肌球蛋白結合肌球蛋白磷酸酶（ MLCP）的位點（MBS）磷酸化[15],抑 制 MLCP 活 性 ,從而增加了肌球蛋白的磷酸化水平， 誘導 RhoA 介導的應力纖維和粘著斑裝配。在平滑肌和非肌細胞中，ROCK還能直接磷酸化 MLC 刺激肌球蛋白收縮[16].

對于所有的肌球蛋白， 大體機制都可以解釋為當肌動蛋白結合到馬達區域時， 馬達運動由于在活性位點 ATP 誘導的構象發生變化引起 RD（ 一種調控區域可以使必須輕鏈、調節輕鏈以及重鏈結合）旋轉[17]. RD 包含著重鏈（ heavy chain,HC）的一段較長的螺旋， 可以使調節輕鏈（ regualatelight chain,RLC） 和 必須輕鏈（ essential light chain,ELC） 以反向平行的方式結合。 輕鏈可以穩定 HC螺旋，然后作為一個較為自由的轉換器，由一種構象轉換為另一種構象去產生工作的動力。

2.2 肌球蛋白輕鏈磷酸化的主要生物學功能

2.2.1 磷酸化對細胞遷移的調節

Totsukawa 等在 2004 年將成纖維細胞作為研究材料發現，MLCK 與 ROCK 在調節 MLC 磷酸化時，在 MLC 所處的不同空間分布中起著不同的作用。 在細胞遷移中 MLCK 誘導細胞周邊和前端肌球蛋白輕鏈磷酸化，ROCK 誘導細胞中心肌球蛋白輕鏈磷酸化。 肌球蛋白Ⅱ在細胞周邊的磷酸化有兩種功能：第一，阻止由肌動蛋白多聚化產生的突觸，以便于細胞遷移；第二，位于細胞周邊的肌球蛋白Ⅱ磷酸化對在運動細胞的前端裝配成熟的粘附結構是必需的[16].

2.2.2 磷酸化對細胞收縮行為的影響

肌球蛋白Ⅱ產生的收縮力不僅為細胞的遷移提供動力，在維持細胞形態，促進傷口愈合，介導胞外基質和細胞信號轉導中也起著重要的作用[16].Beningo 等使用特異性抑制劑 blebbistain 處理后，發現抑制了肌球蛋白Ⅱ的收縮活動， 同時抑制ROCK 也會很大程度減少肌球蛋白Ⅱ的收縮[18].

2.2.3 磷酸化對細胞形態與凋亡的影響

肌球蛋白Ⅱ的活性對于應力纖維粘著斑的形成是必需的。 ROCK 使肌球蛋白結合肌球蛋白磷酸酶（ MLCP）的位點（MBS）磷酸化，抑制肌球蛋白磷酸酶活性，從而增加了肌球蛋白的磷酸化水平，誘導 RhoA 介導的應力纖維和粘著斑裝配。 而且它還與整合素介導的一些信號通路相關[16]（ 表 1） .p114RhoGEF 是一種 RhoA 激活劑，能結合到肌球蛋白 IIA 上，并起到一定的調控作用[19, 20],有數據顯示，p114RhoGEF 能驅動上皮細胞的遷移，變形蟲的運動以及腫瘤細胞的入侵[21].

2.3 肌球蛋白輕鏈磷酸化的最新研究成果

2.3.1 β-抑制蛋白調控的磷酸化

2013 年 Elie Simard 等通過利用兔子的骨骼肌，發現 β-抑制蛋白可以調控由血管緊張肽Ⅱ型1a 受體（AT1aR）刺激的肌球蛋白 MLC 的磷酸化。β-抑制蛋白屬于抑制蛋白家族， 包括 β-抑 制蛋白-1 和 β-抑制蛋白-2, 它可以在哺乳動物組織中廣泛表達[5]. β-抑制蛋白介導 G 蛋白耦聯受體和其他一些受體的信號通路的調控， 在細胞的生長、凋亡及免疫功能中都發揮了重要作用，并且與一些疾病的發病密切相關。 一些研究表明，β-抑制蛋白-1 對于激活 RhoA/ROCK 以及迫使形成肌纖 維 是 不 可 缺 失 的 . 一 些 G 蛋 白 偶 聯 受 體（ GPCRs），如血管緊張肽Ⅱ型 1a 受體（ AT1aR），參與調控細胞收縮[12].而 AT1aR 的拮抗劑Ⅱ（ AngⅡ）能夠很好地防治血管收縮類的疾病[22]. 另外，ElieSimard 等利用酵母雙雜交系統研究發現，由于β-抑制蛋白-1 的 163-253 位氨基酸包含 MYPT-1的結合區域，所以 β-抑制蛋白-1 1-418 位氨基酸和 1-253 位氨基酸會與 MYPT-1 的 643-943 位氨基酸相互作用。 當受到 AT1aR 的刺激時，β-抑制蛋白-2 也會與 MYPT-1（ 肌球蛋白調控區域）相結合。 通過 β-抑制蛋白誘導會激活 AT1aR 的信號通路，促進 MLC 的磷酸化，而 β-抑制蛋白-2/MYPT-1 復 合體會阻斷到 MLCP 亞 基的入口 ,親和性降低，所以 β-抑制蛋白-2 會使 MLC 去磷酸化。 周期性的 MLC 磷酸化會加速細胞收縮[23].

此研究表明，β-抑制蛋白對于 MLC 的磷酸化與去磷酸化是不可缺失的，當肌肉細胞中缺失 β-抑制蛋白-1,在應對 AT1aR 的刺激下，MLC 的磷酸化水平會下降。經實驗發現，這可能是基于兩方面的原因： 其一是 MYPT-1 遠離了 MLCP 的復合體；其二是依賴 β-抑制蛋白-1 的 RhoA 因子水平下降[24],隨后 ROCK 活性損失 ,MLCP 活性增強 ; 但當肌肉細胞中缺失 β-抑制蛋白-2, 在 AT1aR 的拮抗劑 Agonist 的刺激下， 會使 MLC 磷酸化水平升高。 有趣的是，兩種 β-抑制蛋白會相互調控 MLC的磷酸化，缺失 β-抑制蛋白-1 或者 β-抑制蛋白-2 對 細胞收縮和運動都會有相似的效果 . 因此 ,MLC 的 磷酸化對細胞收縮和驅動細胞運動起著關鍵性作用（ 圖 2）。

2.3.2 ELC 與 RLC 相互作用對磷酸化的影響

上文提到，肌球蛋白由重鏈與輕鏈組成，而輕鏈又是由必須輕鏈（ ELC）與調節輕鏈（ RLC）構成。對于所有的肌肉組織， 收縮與釋放都是由細胞內的 Ca2+含量變化調控的。 在橫紋肌中，Ca2+結合到細肌絲的肌鈣蛋白的復合體上激活肌動蛋白-肌球蛋白（ actin-myosin）ATP 酶，因而發生肌肉收縮。

相比較而言， 在軟體動物與脊椎動物的平滑肌和非肌肉細胞中， 收縮的方式有兩種： 其一直接由Ca2+結合到肌球蛋白ⅡELC2上；其二是由 RLC 的N-端區域磷酸化，這種磷酸化由 Ca2+依賴的 ML-CK 調控的。

肌球蛋白調控的結構機制首次以原子級的分辨力揭示，扇貝肌球蛋白Ⅱ的 RD 構造包含著 ELC和 RLC,以及可以結合一部分輕鏈的 HC[25, 26]. 在扇貝肌球蛋白中，Ca2+會結合到 ELC-N 端結構域Ⅰ中的 EF 臂的上。 2012 年 Shaowei Ni 等通過用雞的平滑肌 HMM 在 Sf9 細胞中表達后得到 HC、RLC 與 ELC 的全長。 研究發現，必須輕鏈（ ELC）與調節輕鏈（ RLC）交界處的修飾會阻斷激活平滑肌肌球蛋白依賴的磷酸化。他們表達了 16 個平滑肌水解重酶解肌球蛋白（ SmHMM），兩條 MLC 與周圍的 HC 的銜接處發生突變。 結果發現：1）RLC被 MLCK 磷酸化；2） 亞基組成是正常的，突變并不會降低 ELC 或者 RLC 結合到 HC 的能力；3）依賴肌動蛋白激活的 ATPase 的動力學以及在體外運動的 機 械 性 能 在 去 磷 酸 化 的 狀 態 下 與 WTHMM 相一致；4） 對于磷酸化的水解重酶解肌球蛋白（ HMM），缺失肌動蛋白（ actin）狀態下其 ATPase活性會被抑制。 另外，當阻斷 RLC 與 ELC 的相互作用時， 磷酸化不再有激活 HMM 捕捉肌動蛋白的能力。 經研究發現，這種現象與 RLC 的 M129Q與 G130C 的突變有關。 M129Q 和 G130C 對于穩定結構，激活捕捉 actin 的能力起著關鍵作用。 同時研究發現， 與 Asp-131 相互作用的 HC 突變體Q826A,也 可以起穩定 RLC/ELC 的 相互作用（ 圖3） . 通過突變 HC、RLC 以及 ELC 去破壞三者之間的相互作用，若不發生磷酸化，所有的突變體都與野生型（ wt）的現象相似，相反，肌球蛋白會運動緩慢，ATPase 活性下降。 分子動力學研究表明，阻斷RLC/ELC 的相互作用會導致肌球蛋白彈性增加，很可能會阻礙磷酸化的激活。 因此作者猜想，RLC磷酸化重要的功能就是去維持 RLC 與 ELC 相互作用的完整性。 一旦 RLC/ELC 相互作用阻斷，結構破壞，就不會再受到磷酸化的調控的影響[27].

3 肌球蛋白重鏈的磷酸化

非肌肉肌球蛋白Ⅱ是一個六聚體復合物，由兩條重鏈（ NMHC-Ⅱ）、兩條必須輕鏈、兩條調節輕鏈組成。 在脊椎動物中，NMHC-Ⅱ有 3 種異構體，分別是 NMHC-ⅡA（MYH9）、NMHC-ⅡB（MYH10）以及 NMHC-ⅡC（MYH14）[28],在組織和細胞形態中都會表現出不同的模式[29]. 雖然 NMHC-Ⅱ的異構體會有很高的保守性， 但是一些酶的活性還是有些差異的[30]. 另外，NMHC-Ⅱ在細胞中的定位也不一樣[31],也會與不同的蛋白結合[32].

3.1 重鏈磷酸化的作用機制

在哺乳動物細胞中， 肌球蛋白Ⅱ調節輕鏈的絲氨酸 19（ Ser-19）的磷酸化普遍地參與了體內裝配的調控[33],但是，存在一種證據證明非肌肉肌球蛋白Ⅱ裝配的調控是可以通過重鏈的磷酸化來實現的，特別是蛋白激酶 C（ PKC） 與酪蛋白激酶2（ CK2）對肌球蛋白Ⅱ-A 與Ⅱ-B 有著至關重要的作用，PKC 會使 NMHC-ⅡA 的 Ser1916 磷酸化[34].

通過 PKC 或者 CK2 使重鏈磷酸化會減少肌球蛋白Ⅱ異構體裝配成肌絲[35]. 涉及到磷酸化作用，肌球蛋白Ⅱ-A 裝配可以通過結合轉移因子 mts1 或者鈣結合蛋白 S100A4 來調控[36]. S100A4 會優先地結合到非肌肉肌球蛋白Ⅱ-A[37],然后促進單體的、 未裝配的肌球蛋白Ⅱ-A 裝配[38]. CK2 使NMHC-ⅡA 的 Ser1943 磷酸化會抑制鈣結合蛋白S100A4 結合以及 S100A4 誘導的單纖維的裝配，S100A4 介 導的肌球蛋白 Ⅱ-A 肌 纖維的去磷酸化[39]. 因此，重鏈的磷酸化以及 Ca2+的結合會調控S100A4 與肌球蛋白Ⅱ-A 的相互作用。

3.2 肌球蛋白重鏈磷酸化的生物學功能及最新研究成果

3.2.1 重鏈磷酸化對癌細胞遷移的調控

2007 年 Natalya G. Dulyaninova 等研究發現，肌球蛋白Ⅱ-A 重鏈磷酸化可以調控 MDA-MB-231 癌細胞的遷移。 研究中選取了人類胸腺癌細胞肌球蛋白Ⅱ-A 重鏈，其磷酸化會依賴表皮生長因子（ epidermal growth factor, EGF）。 EGF 通過刺激 MDA-MB-231 細胞會導致裝配與重鏈磷酸化的瞬時增加。 細胞經過 EGF 刺激，肌球蛋白Ⅱ-A重鏈會在酪氨酸激酶 2 位點（ S1943）磷酸化，肌球蛋白Ⅱ-A 重鏈 S1943E 與 S1943D 突變體會遷移到創傷位點。 相比較而言，細胞表達的 S1943A 突變體遷移變慢，充分證明肌球蛋白Ⅱ-A 重鏈磷酸化會介導癌細胞的遷移[40].

3.2.2 棘 阿米巴原蟲肌球蛋白 Ⅱ重 鏈磷酸化對MgATPase 活性的調控

2012 年 Liu 等 通過研究發現了棘阿米巴原蟲肌球蛋白Ⅱ受肌動蛋白激活的 MgATPase 活性是受肌球蛋白馬達區域絲氨酸 639 磷酸化調控的， 至今為止并未發現還有其他的肌球蛋白會受這種方式來調控[41]. 先前推測棘阿米巴原蟲肌球蛋白Ⅱ有 MgATPase 活性， 這種活性可以通過兩條重鏈 C-端非螺旋區域的重復序列中 4 個 Ser殘基磷酸化來抑制， 研究者利用重組的 WT 與突變的肌球蛋白重新進行了研究， 得到了相反的結論。 HMM 與亞片段 1 有受肌動蛋白激活的 MgATPase 的活性，通過磷酸化作用活性衰減。 通過質譜分析，鑒定了重鏈上的 5 種 Ser 可以發生磷酸化，4種 Ser 存在于非螺旋結構中，Ser639 存在于馬達區域的環 2 中。 通過將 Ser639A 突變，仍然檢測到肌球蛋白有 MgATPase 活性，并不會因 Ser 磷酸化而受到抑制。 相反， 亞片段 1 與全長的肌球蛋白的Ser639D 突變失活，與 Ser 磷酸化無關。

4 小結與展望

肌球蛋白是肌原纖維粗絲的組成單位， 存在于平滑肌中，在肌肉運動中起重要作用。用蛋白分解酶處理可以將其分割為頭部 （ H-酶解肌球蛋白）和尾部（ L-酶解肌球蛋白）。 肌球蛋白作為其重要功能如肌肉收縮、遷移、胞質分裂、細胞凋亡等機制中主要的調節結構域， 其磷酸化與去磷酸化在功能調控方面起著重要的作用。 研究肌球蛋白輕鏈與重鏈的磷酸化，為尋求一些肌肉收縮以及其他疾病如慢性阻塞性肺病、充血性心肌衰竭[42]等方面提供了重要的參考依據。更值得一提的是，近年來隨著腫瘤細胞研究越來越熱， 進而發現了肌球蛋白磷酸化可以介導癌細胞的遷移， 還有一些調控因子可以促進腫瘤細胞的入侵， 這為以后更好地研究癌細胞的運動提供了佐證。但其調控機制并未見過多的文章對其進行闡述，因此，腫瘤運動與遷移很可能成為未來的一個研究方向。 另外最近幾年更多的研究發現，肌球蛋白不僅可以發生磷酸化，其被病毒侵襲或者在激素水平（ 如皮質醇）下，肌球蛋白被自身泛素化的報道也屢見不鮮， 但其一些作用機制與功能尚不清楚，因此，肌球蛋白泛素化有可能會成為未來繼磷酸化之后的又一研究熱點。

參考文獻（References）：

[1] ANDRUCHOV O, ANDRUCHOVA O, WANG Y, et al. De-pendence of cross -bridge kinetics on myosin light chain iso -forms in rabbit and rat skeletal muscle fibres[J]. Journal of Physiol-ogy, 2006, 571（Pt 1）：231-242.

[2] SWEENEY H L, HOUDUSSE A. Structural and functional in -sights into the Myosin motor mechanism[J]. Annual Review of Bio-physics, 2010, 39（ 10） :539-557.

[3] SANTOS M, MOURA R S, GONZAGA S, et al. Embryonicessential myosin light chain regulates fetal lung developmentin rats[J]. American Journal of Respiratory Cell and MolecularBiology, 2007, 37（3）：330-338.

[4] 朱道立， 陳佩林， 王康樂。 骨骼肌肌球蛋白 II 的研究進展[J].生物學教學 （ ZHU Dao-li,CHEN Pei-lin,WANG Kang-le.Theresearch progress of skeletal muscle myosin II[J]. Biology Teaching），2010（11）：8-10.