TRAF（ TNF receptor associated factor） 家 族蛋白是一類具有相同 C 末端保守結構域的細胞內接頭蛋白， 最早被發現能夠介導腫瘤壞死因子受體（ TNFR）家族的細胞內信號轉導并因此得名，但后來的研究發現 TRAF 蛋白還能夠與包括 Toll 樣受體（ TLR）家族、IL-1 受體家族以及視黃酸誘導基因蛋白 I（ RIG-I） 樣受體家族在內的多種受體蛋白相互作用并傳遞信號， 目前已經在哺乳動物中發現了 7 種 TRAF 蛋白。 TRAF 家族蛋白通過對細胞生存、增殖、分化和凋亡的調控，廣泛參與包括免疫、胚胎發育、應激反應等多種生物學過程并在其中發揮著重要的作用[1]. TRAF4 是 TRAF家族蛋白中比較特殊的一個，本文對 TRAF4 的結構和功能做一綜述。
1 TRAF4 蛋白的結構和一般性狀
人類 TRAF4 基因編碼一個 470 aa 組成、相對分子質量 54 kD 的銜接蛋白，在胞漿、細胞核以及細胞膜上均有定位。 TRAF4 蛋白主要包含 3 個結構域， 從 N 端到 C 端依次為一個 RING-finger結構域、7 個連續的鋅指結構域、1 個 TRAF 結構域。 其中 TRAF 結構域是 TRAF 家族蛋白的特征性結構，除了 TRAF7,所有的 TRAF 蛋白家族成員都包含一個 C 末端 TRAF 結構域。 按照結構和功能的不同，TRAF 結構域又可以被分為 TRAF-N 和 TRAF-C 兩部分，其中 TRAF-N 部分由多個α 螺旋組成， 在不同 TRAF 家族成員中保守性較差[2];而 TRAF-C 部分序列高度保守，折疊形成一個 8 鏈 β-三明治結構， 又被稱作 MATH（ meprinand TRAF-homology） 結 構域 ,主要介導 TRAF 蛋白的三聚化以及作為與信號分子直接或間接結合的位點（ 圖 1）。 三聚化的 TRAF 蛋白形成蘑菇樣結構，3 段 TRAF-N 結構域的 α-螺旋平行排列在一起形成的卷曲螺旋結構，構成蘑菇樣結構的柄，TRAF-C 構成蘑菇樣結構的傘蓋（ 圖 2） . 相比于其他 TRAF 家族成員，TRAF4 的 TRAF-N 結構域要更短，僅由 3 個 7 肽重復區構成，而其他 TRAF家族成員至少由 10 個以上 7 肽重復區構成。這就造成 TRAF4 蛋白與其他 TRAF 蛋白的結合能力很弱[3~5].除 TRAF1 蛋白外，所有的 TRAF 家族成員都包含一個位于 N 末端的 RING-finger 結構域以及幾個連續的鋅指結構域。 TRAF4 的 RING-finger結構域為兩個鋅指結構組成的 C3HC3D 型模體。
RING-finger 結構域在泛素途徑中具有重要的作用， 能夠將泛素酶與其底物蛋白相連， 發揮類似E3 連接酶的作用[6]. 3 個富含半胱氨酸的 CART結構域 （ 與 RING-finger 結構域和 TRAF 結構域相關的富含半胱氨酸結構域（cysteine rich domainassociated with RING and TRAF domain） 位 于RING-finger 結構域和 TRAF 結構域之間，每一個CART 結 構域均由一個外顯子編碼 , 包含兩個HC3HC3 鋅 指 模 體 . TRAF4 是 唯 一 具 有 3 個CART 結 構域的 TRAF 家 族成員 ,TRAF4 也 因此結構域曾被命名為 CART1. 后來的研究顯示，這段富含半胱氨酸區域共由 7 個鋅指模體構成，其中前 6 個鋅指模體為 C2HC 型，而第 7 個為 C2H2型。 在 N 端第一個 CART 結構域中存在 1 個核定位信號，此外，在 RING-finger 結構域 N 端的上游也存在 1 個核定位信號，TRAF4 也是 TRAF 家族中唯一具有核定位信號的成員[3].
與 TRAF 蛋白家族的其他成員不同，TRAF4與包括 TNFR1、TNFR2、Fas、CD40 在內的大多數TNFR 家族成員不存在直接的相互作用， 與淋巴毒素 β 受體（ LTβR）和神經生長因子受體（ NGFR）僅存在微弱的相互作用， 這種作用能夠產生怎樣的生理作用仍然未知，并且 TRAF4 的高表達并不能像 TRAF2、TRAF5、TRAF6 那樣激活 NF-κB[7].
TRAF4 主 要通過間接作用或形成復合體的方式在胞漿、胞膜和細胞核中遷移而發揮作用，其作用發揮涉及 JNK、ERK、PI3K/Akt、Wnt 等多條信號通路[8~11],截至目前 ,JNK 途 徑被認為是其中最重要的一條，TRAF4 的大部分生物學效應伴隨 JNK途徑的激活， 但 TRAF4 單獨激活 JNK 途徑的能力很弱， 必須與其他蛋白如 MEKK4 等結合之后才具有顯著激活 JNK 途徑的能力[12].
進化分析顯示，TRAF1、2、3、5 是在脊椎動物的進化過程中出現的， 與 TNFR 家族形成于同一階段， 這一結果說明此 4 種 TRAF 家族蛋白的功能與 TNFR 家族蛋白的功能是相關的。 TRAF4 和TRAF6 在進化過程中出現較早，在低等的腔腸動物中即已發現 TRAF4 的同源類似物，并且無脊椎動物和脊椎動物的 TRAF4 同源蛋白在胚胎發育過程中都起著相似的作用[13],據此推斷 TRAF4 可能是 TRAF 家族中古老的成員之一， 并且其發揮功能是 TNFR 非依賴的。
2 TRAF4 與腫瘤
TRAF4 最早在乳腺癌患者的轉移淋巴結中被鑒定出來[14]. 之后的研究顯示，除了乳腺癌，在包括肺癌、子宮癌、前列腺癌、結腸癌在內的多種腫瘤組織中都存在 TRAF4 蛋白的高表達，陽性率接近 1/2, 在肺癌中更是高達 60%. 并且 TRAF4高表達只局限在腫瘤細胞中， 周圍的基質細胞則表達正常[15]. 一項基于 40 個獨立的基因芯片篩查實驗的整合分析顯示，67 個基因的高表達可以作為腫瘤的特征性標記物，TRAF4 即為其中之一[16].
并且 TRAF4 高表達的乳腺癌患者對化療藥物的敏感性降低，預后較差[17]. 腫瘤中 TRAF4 蛋白的高表達常常伴隨著亞細胞定位的異常。 雖然TRAF4 蛋白序列中存在兩個可能的核定位信號，但內源性 TRAF4 的核定位目前僅在腫瘤細胞中發現。 在大多數正常細胞中，TRAF4 主要以膜相關的形式定位， 而在侵襲性腫瘤細胞中，TRAF4主要定位在胞漿中， 此外， 還有大約 20%的TRAF4 陽性腫瘤定位于細胞核中[15]. TRAF4 的高表達和定位異常有可能成為腫瘤診斷的一個標志物，并且這種異常表達有可能參與腫瘤的發生。
3 TRAF4 的生物學功能
3.1 TRAF4 的生理表達及其在發育中的作用
在成人幾乎所有組織上皮的基底細胞層中都存在 TRAF4 蛋白的基礎表達，并且各組織間表達水平差異不大[18]. 在成年小鼠的各組織中也檢測到了基礎水平 TRAF4 的表達，但其中表達水平最高的部位是中樞神經系統的海馬、 嗅球以及小腦的浦肯野細胞[19].
在小鼠的胚胎中，TRAF4 廣泛表達在各個發育中的器官，其中中樞神經系統、外周神經系統和感覺器官的神經組織表達水平最高。 TRAF4 缺陷的純合子小鼠顯示出明顯的上呼吸道缺陷， 并導致約 30%的小鼠在胚胎期死亡，幸存的 TRAF4 缺陷小鼠表現出典型的共濟失調癥狀， 并發生多種低滲透性改變，包括氣管和中軸骨骼（ 胸骨、肋骨、尾骨）的嚴重畸形，以及導致輕度脊柱裂表型產生的神經管閉合缺陷[19~21]. TRAF4 表達在少突膠質細胞分化的每一個階段，TRAF4 敲除導致嚴重的中樞神經系統髓鞘不穩定和缺失。 此外， TRAF4能夠通過 NgR/p75NTR/RhoA 信號途徑抑制肌動蛋白細胞骨架重排從而促進軸突再生和抑制神經細胞的凋亡，對神經元具有保護作用[22].TRAF4 在小鼠中樞神經系統中的表達是受到調控的， 在小鼠出生后 4 周內，TRAF4 的表達明顯下調。 在包括爪蟾、 斑馬魚、 果蠅在內的多種模式生物中，TRAF4 均表現出類似小鼠的表達模式[23~26].
綜上所述，TRAF4 在大多數生物體內各器官廣泛表達，但高表達于神經系統，對各系統發育，尤其是神經系統的發育起著不可或缺的作用。
TRAF4 調控發育的機制目前尚未明了，有研究顯示，TRAF4 能夠正向調控 TGF-β/BMP 和 TGF-β/nodal/activin 信號途徑，此兩個途徑均與胚胎的發育密切相關[24]. 此外，還可能與 TRAF4 對細胞極性和凋亡的調控有關。
3.2 TRAF4 與細胞極性
TRAF4 有 多種不同的亞細胞定位 , 包括胞漿、細胞膜和細胞核。 外源表達的 TRAF4 主要存在于細胞間接觸點部位的細胞膜上。 在體外培養的極化上皮細胞和正常人乳腺標本中，TRAF4 與緊密連接的標志性蛋白共定位于細胞與細胞連接點上。熒光漂白恢復實驗顯示 TRAF4 與緊密連接的相關性是高度動態的，TRAF4 在緊密連接和細胞漿間不斷移位。這一結果說明 TRAF4 可能是正常上皮細胞間連接的信號傳感器。與之相反的是，在分化差的上皮細胞腫瘤中，TRAF4 或者彌漫性分布在胞漿中， 或者在胞漿或胞核中呈現局灶性分布， 提示這種細胞間信號轉導功能可能被削弱[8,9].
分節極性蛋白 Armadillo 是細胞間粘附的重要調節因子， 也是 Wnt 途徑重要的下游信號分子。 在果蠅胚胎發育過程中，Armadillo 與 TRAF4發生直接的相互作用，以 TNFR 和 JNK 非依賴的方式精細調節中胚層細胞間粘合連接的形成[25].
在人類細胞中， 可能存在類似的相互作用。 β-catenin 是果蠅 Armadillo 在脊椎動物中的同源蛋白，最近的研究發現，TRAF4 可以與 β-catenin 結合并影響 β-catenin 的亞細胞定位， 高表達的TRAF4 可 以使 β-catenin 由 胞漿進入細胞核 ,進而通過激活 Wnt 途徑促進乳腺癌細胞的增殖[11].TRAF4 和 β-catenin 在脊椎動物胚胎發育中的作用機制目前尚無報道。
TGF-β 信 號途徑是細胞極性的關鍵調節因素，參與上皮-間充質細胞的轉化和腫瘤的發生，被看作是腫瘤治療的一個潛在靶點。 研究顯示TRAF4 在 TGF-β 誘導的 SMAD 和非 SMAD 途徑中起著關鍵的作用。 當 TGF-β 受體受到刺激的時候，TRAF4 被活化的 TGF-β 受體復合物募集，拮抗 E3 泛素連接酶 SMURF 的作用 （ TRAF4 作為SMURF2 的主要 E3 連接酶， 同時 TRAF4 本身可以作為 SMURF1 和 SMURF2 兩種 E3 連接酶的底物）[24,27, 28],促進去泛素酶 USP15 向 TGF-βI 型受體（ TβRI） 的募集。 這兩個過程都能夠促進 TβRI 在胞漿膜上的穩定性進而促進 TGF-β 信號途徑。 此外，TGF-β-TRAF4 的相互作用可以激活 Lys63 相關的 TRAF4 多聚泛素化并激活 TGF-β 活化激酶（ TAK1） 及其下游的 p38 MAP 激酶和 NF-κB 級聯反應。 敲除 TRAF4 可以引起 E-cadherin 的高表達并抑制細胞的遷移[29]. TRAF4 對于 TGF-β 誘導的遷移、 上皮間葉轉化和乳腺癌轉移起著關鍵的作用。
最近的研究顯示，TRAF4 分子具有一個獨特的磷脂酰肌醇結合結構域， 通過與磷脂酰肌醇的相互作用，TRAF4 負向調節緊密連接并促進細胞的遷移。 TRAF4 的高表達可能通過破壞緊密連接的穩定性和促進細胞遷移來促進乳腺癌的進程[30].
目前看來，對細胞極性的調控是 TRAF4 最為重要的生物學功能，明確 TRAF4 在細胞極性調控中的作用機制對于理解 TRAF4 在發育和腫瘤發生中的作用具有重要的意義。
3.3 TRAF4 與凋亡
TRAF4 在凋亡中的作用存在兩種截然相反的結論。 例如，敲除 TRAF4 可以誘導浦肯野細胞發生凋亡[21];TRAF4 高表達可以使 HEK293 細胞抵抗 anti-Fas 抗體誘導的凋亡[31];TRAF4 敲除的MCF-7 細胞被 TNF-α 刺激后， 早期凋亡細胞比例明顯增高[32]. 其抗凋亡機制可能是 TRAF4 依賴其 TRAF 結構域與 p53 競爭性結合去泛素化酶HAUSP,從而抑制了 p53 的去泛素化 ,降低其穩定性[17]. 另外的一些研究卻顯示 TRAF4 具有促進凋亡的能力。 例如，在果蠅中，TRAF4 的同源蛋白DTRAF1 可 以 被 果 蠅 TNF/TNFR 同 源 物 Eiger/Wengen 的相互作用所募集，繼而通過凋亡信號調節激酶 1（ ASK1） 和 JNK 途徑誘導果蠅細胞發生凋亡[33,34];在體外培養的 293T 細胞中 ,TRAF4 與神經生長因子受體 p75 NTR 直接作用，抑制 NF-κB 的激活，誘導細胞發生凋亡[35];在 頭頸部腫瘤中，TRAF4 可以被 p53 家族成員（ p63,p73,p53）正向調控[36,37];放射線誘導淋巴細胞凋亡和噪聲誘導耳蝸細胞凋亡過程中都會出現 TRAF4 的高表達[38,39];在多種不同來源的細胞系中，TRAF4 的高表達可以誘導凋亡并且抑制集落形成， 并且與p53 的 狀態無 關 . 這些看似 矛 盾 的 結 果 說 明TRAF4 在細胞生存、死亡的調控上具有細胞類型特異性。 TRAF4 對凋亡的調控很可能參與胚胎的發育和腫瘤的發生。
3.4 TRAF4 與活性氧（ROS）的生成
ROS 是正常氧代謝的副產物，具有多種重要的生物學活性，包括參與殺菌、炎癥反應以及內皮細胞的激活 等 . NADPH 氧 化 酶 2 （ NOX2） 是NADPH 氧化酶中分布最廣的一個亞型，通過質膜傳遞電子給分子氧產生超氧化物，參與殺菌、炎癥和上皮細胞的激活。 P47phox 是 NOX2 的一個胞漿內亞基，也是目前已知所有 TRAF4 結合蛋白中與 TRAF4 作用的機制最為明確的一個。 研究證實，TNF-α 能夠誘導 p47phox 發生 PKC 依賴的磷酸化，TRAF4 與磷酸化 p47phox 的 C 末端結合并攜帶 p47phox 向細胞膜轉位， 這種轉位能夠誘導JNK 的 激活 , 并引起 NOX2 的 激活和 ROS 的 產生[40].
GPIb-IX-V 和 GPVI 是兩種血小板糖蛋白受體，分別與血管性血友病因子（ VWF）和膠原蛋白結合起始凝血過程。 在血小板活化過程中都會產生大量的 ROS,而 ROS 又會反過來調控血小板的活化，其機制未知。 研究顯示，TRAF4 和 p47phox可 以 作 為 GPIb-IX-V 和 GPVI 的 結 合 伴 侶 ,GPIb-IX-V 和 GPVI 的胞漿段與 TRAF4 的 TRAF結構域、p47phox 的 SH3 結構域以及 Hic-5 形成一個復合體，從而使 NOX2 活化[41]. 這一發現為解釋氧化還原信號通路與血小板活化間的關系提供了一個合理的依據。
3.5 TRAF4 與免疫
TRAF 家族是固有免疫信號通路中重要的接頭蛋白， 通過與 TNFR 和 Toll/IL1 受體家族成員作用， 經 NF-κB 和 MAPK 的激活誘導免疫和炎癥反應。但 TRAF4 似乎是一個例外， TRAF4 缺陷的小鼠 T/B 淋巴細胞、粒細胞、巨噬細胞、樹突細胞分化和功能均正常， 僅表現為樹突細胞的遷移能力降低[42]. TRAF4 不能與大多數 TNFR 和 TLR直 接 作 用 ,TRAF4 與 不 同 的 TLR 成 員 共 轉 染293T 細 胞會對 TLR 介 導的 NF-κB 和 IFN-β 激活產生劑量依賴性抑制作用[43],提示其對固有免疫發揮的是抑制作用。 目前看來，TRAF4 發揮免疫抑制作用主要與 NOD2 途徑及其與 TRAF6 的相互作用相關。
NOD2 （nucleotide-binding oligomerization do-main containing 2）是一種細胞內模式識別受體，在免疫平衡中起著重要的作用。 NOD2 在包括克羅恩氏?。?節段性結腸炎）、Blau 綜合征等炎癥性疾病的發病中起著重要的作用。有研究顯示，TRAF4可能是 NOD2 途徑的一個關鍵負調控子。 TRAF4是 IκB 激酶 α （IKKα） 的底物，其 Ser426 可以被IKKα 磷酸化， 磷酸化的 TRAF4 能夠與 NOD2 蛋白結合并抑制 NOD2 誘導的 NF-κB 激活及殺菌作用。Ser426 位于 TRAF4 分子特有的一個膨大的β 凸起中，其他的 TRAF 家族蛋白均無此結構，這也解釋了在所有的 TRAF 家族蛋白中，僅 TRAF4是對固有免疫起抑制作用[44,45].
作為 TRAF 家族中另一位古老的成員， 不同于 TRAF4,TRAF6 能夠介導多種 TNFR 家族的信號轉導，在固有免疫中發揮激活作用。 實驗顯示，TRAF4 可 與 TRAF6 發 生直接或間接的相互作用，拮抗 TRAF6 的生物學功能。 早期的研究即已發現，TRAF4 能夠與 p47phox 協同， 通過對抗TRAF6 和 β 干擾素 TIR 結構域銜接蛋白（ TRIF）的作用而抑制 TLR 介導的信號轉導[43]. 新近的研究顯示，TRAF4 與 TRAF6 的對抗作用還體現在IL-17 信號的轉導中。 IL-17 是 Th17 細胞分泌的標志性細胞因子，IL-17 與 IL-17R 結合后募集IL-17 途徑中兩個關鍵信號分子肌動蛋白相關基因 1（ Act1）和 TRAF6,形成 IL-17R-Act1-TRAF6信號復合物，進而激活 NF-κB 和 MAPK 途徑，促進炎癥性細胞因子分泌， 在多種炎癥反應和自身免疫疾病的發病中起著重要作用。 TRAF4 和TRAF6 在 Act1 上 具有相同的結合位點 , 因而TRAF4 可以與 TRAF6 競爭結合 Act1, 從而抑制IL-17 信號轉導。 將野生型 Th17 細胞轉入 TRAF4缺陷小鼠能夠在極短的時間內誘導自身免疫性疾病的發生[46].
此外，TRAF4 在免疫中的作用還與糖皮質激素誘導 TNF 受體（ GITR）有關。 GITR 主要表達在T 細 胞 、B 細 胞和巨噬細胞表面 ,TRAF4 能 夠與GITR 胞漿段發生間接作用， 通過 JNK 途徑增強GITR 對 NF-κB 激活， 拮抗抑制性 T 細胞的功能而促進輔助性 T 細胞的激活[47]. 看起來 TRAF4 似乎對適應性免疫有一定的促進作用， 但這一結論并未得到體內實驗的支持。
4 總結與展望
作為 TRAF 家族最古老的成員之一， 有關TRAF4 的研究卻相對較少，TRAF4 蛋白功能的認知仍然模糊。 僅就目前的研究來看， 大多數情況下，TRAF4 與 TNFR 家族其他成員沒有明顯的直接作用或者作用很弱， 主要通過間接作用或形成復合體的方式在胞漿、 胞膜和細胞核中遷移而發揮作用， 其作用發揮涉及 JNK、ERK、PI3K/Akt、Wnt 等多條信號通路， 但目前尚無法準確歸納出TRAF4 在信號通路中的確切位置 . 多項有關TRAF4 的研究出現了諸多矛盾的研究結果，例如對凋亡的影響、對 NF-κB 以及對某些信號途徑的作用等，這充分說明 TRAF4 的生物學功能復雜而多樣。
作為一種銜接蛋白， 鑒定其相互作用成分及作用機制將是揭示 TRAF4 神秘作用的關鍵。 目前，已經鑒定出的 TRAF4 結合蛋白多達 20 余種，涉及膜受體、蛋白激酶、胞漿銜接蛋白、泛素途徑相關酶、凋亡相關蛋白等（ 表 1），其中很大一部分蛋白與 TRAF4 的互作機制尚未完全清楚，仍有待進一步研究。 同時有理由相信，與 TRAF4 相互作用的成分并非僅僅以上 20 余種蛋白，以目前的技術水平，一些短暫的、低水平表達蛋白以及修飾蛋白相互作用及間接相互作用的鑒定仍然存在一定的困難，并且與 TRAF4 作用的成分很可能并不局限于蛋白質。類似于轉錄因子的拼版理論，不同細胞內包含 TRAF4 作用成分的不同組合， 導致TRAF4 產生細胞特異的多樣的生物學效應，這是造成 TRAF4 生物學效應復雜多樣的最可能原因。分子間相互作用鑒定和定量技術的不斷完善將會為 TRAF4 作用機制的研究提供有力支持。
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