自從 20 世紀 40 年代化學殺蟲劑廣泛應用以來,化學防治逐漸成為蚊蟲防治的主要方法,但是長期大量的使用化學殺蟲劑,不僅對環境造成了嚴重的污染,給人類的生活、健康帶來了嚴重的傷害,蚊蟲抗藥性也隨之出現,其案例在世界各地大量報道.
為此,人們更加關注生物防治,期望找到一條對環境無污染,又可高效滅蚊的防治途徑.在已有的生物防治中,主要包括病原微生物滅蚊、捕食性天敵滅蚊和轉基因工程藍藻防治蚊蟲,其中,在應用病原細菌滅蚊方面研究較多.20 世紀 60 年代,各國學者分離篩選了多種可用于蚊蟲防治的微生物,其中研究最為深入的是球形芽孢桿菌\\(Bacillus sphaericus,Bs\\)和蘇云金芽孢桿菌以色列亞種 \\(Bacillus thuringiensisisraelensis,Bti\\)[1].蘇云金芽孢桿菌具多種類型的殺蟲晶體蛋白,具有殺蟲特異性強,對人、畜及非目標昆蟲無毒副作用,安全性好,不污染環境[1].球形芽孢桿菌是一種在自然界中廣泛分布、形成亞末端膨大孢子囊和球形芽孢的好氣芽孢桿菌.但是由于這兩種微生物產生的毒素不同,作用方式不同,其滅蚊的范圍也不相同.因此,對近年來球形芽孢桿菌 Mtx1 毒蛋白和蘇云金芽孢桿菌 Cry4Ba 毒蛋白基因工程研究進展進行綜述.
1 球形芽孢桿菌 Mtx1 研究
球形芽胞桿菌是革蘭氏陽性菌,廣泛的分布在自然界中.球形芽孢桿菌在營養期可以產生 Mtx 毒蛋白,Mtx 毒蛋白存在于低毒力和部分高毒力菌株中[2].已報道的有 3 種類型的 Mtx 蛋白:Mtx1、Mtx2 和Mtx3.Mtx1 毒蛋白是一種分子量為 100 kDa 的可溶性毒素,由 870 個氨基酸組成.它的 N-末端有一個具有 G-細菌信號肽特征的序列[3].
1.1 Mtx1 簡介
1989 年 Thanabula 等[4]發現 Mtx1 殺蚊毒蛋白對蚊幼蟲具有高毒力,純化后的 Mtx1 殺蚊毒蛋白同 Bin晶體毒素的殺蚊活性相當.1993 年 Thanabula 等[5]通過研究發現 Mtx1 毒蛋白在中腸胰蛋白酶的作用下可以分解為分子量為 27 kDa 和 70 kDa 的 2 個片段,并認為它們分別來自于 Mtxl 毒蛋白的 N-末端和C-末端,N-末端能使蚊幼蟲中腸細胞內的 ADP 核糖基部分與蛋白質的氨基酸殘基發生連接反應,從而使蛋白質失去功能.C-末端能引起離體培養的蚊蟲細胞發生病變,然而,只有當 2 個片段同時存在時才對蚊幼蟲有毒殺作用.1995 年 Thanabula 等[6]通過對球形芽孢桿菌 9 種不同株系的研究發現,這 9 種株系孢子細胞中的 Mtx1 毒蛋白表達非常低,以致無法檢測出.其中 5 種株系在營養生長期能夠產生 Mtxl毒蛋白,而研究來源于 6 個 DNA 同源組的球形芽孢桿菌發現:球形芽孢桿菌可以產生蛋白酶.為了確定該蛋白酶的作用,將 Mtx1 毒蛋白基因通過使用原始啟動子表達在球形芽孢桿菌 1693\\(蛋白酶陰性\\)多拷貝質粒和球形芽孢桿菌 13052\\(蛋白酶陽性\\)中.球形芽孢桿菌 1693 不產生蛋白酶,它的營養生長細胞和孢子細胞均有高水平的 Mtx1,而球形芽孢桿菌13052 產生蛋白酶,它的 Mtx1 含量非常低.從而證明該蛋白酶可以降解孢子中的 Mtx1 毒蛋白.
1.2 Mtx1 基因工程研究
作為微生物殺蟲劑的球形芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌同樣也面臨著靶標害蟲產生抗藥性問題,但蘇云金芽孢桿菌的壓力較小,因為蘇云金芽孢桿菌伴孢晶體中包括多種毒蛋白,多種混合的毒蛋白能夠延緩抗藥性的產生與發展;球形芽孢桿菌則易使靶標害蟲產生抗藥性,主要是由于是單因子遺傳抗性,這方面資料在法國、印度、巴西、中國等世界各地已有大量的案例報道.如何防止靶標害蟲產生抗藥性是當前研究熱點內容之一,傳統抗藥性管理策略包括輪換和混合使用蘇云金芽孢桿菌與球形芽孢桿菌,而新策略包括基因工程增加殺蚊幼毒素的多樣性和增加殺蚊產品的種類,避免殺蟲劑抗藥性的產生[7].2003 年 Boonhiang Promdonkoy 等[8]將來自球形芽孢桿菌 2297 中的 Mtx1 殺蚊基因在大腸桿菌中克隆表達,分析克隆的 DNA 序列是由 870 個氨基酸構成,但 Mtx1 殺蚊基因在大腸桿菌中表達非常低,或者表達的是融合蛋白.在敲除假定先導序列后,蛋白表達水平提高,敲除后的基因表達的是谷胱甘肽MTX 融合蛋白 GST-tMtx1,GST-tMtx1 對致倦庫蚊Culex quinquefasciatus 幼蟲具有高毒,但是對大劣按蚊\\(Anopheles dirus\\)和埃及伊蚊\\(Aedes aegypti\\)幼蟲低毒.2003 年張蓓華等[9]將來源于球形芽孢桿菌SSII-1 的 Mtx1 毒素基因克隆至穿梭載體 PBU4 上,得到 Mtx1 插入方向相反的重組質粒 PMT19 和PMT4,發現含有重組質粒 PMT19 和 PMT4 的蘇云金芽孢桿菌轉化子 B-PMT19 和 B-PMT4 在營養體生長階段對敏感蚊幼和抗性幼蟲也具有毒性,毒力與野生型 SSII-1 相當.2007 年楊艷坤等人[10]采用常規生物測定法確定了純化的球形芽孢桿菌缺失信號肽的 97 kDa 營養期 Mtx1 毒蛋白和蘇云金芽孢桿菌27.3 kDa 的 Cry1Aa 晶體蛋白對致倦庫蚊幼蟲的殺蟲活性,結果表明:Mtx1 和 Cry1Aa 不同比列的混合物對致倦庫蚊的毒力比單獨毒素蛋白高,2 種毒蛋白對目標蚊幼蟲具有協同毒殺作用,在 LC98處理濃度下,Mtx1 和 Cry1Aa 按 3∶1 混合的混合物 LT50值比單獨使用 Mtx1 提前了 6.36 h,提高了對目標蚊蟲的毒力并縮短半致死時間.2009 年 Ampron Rungrod 等[11]將球形芽孢桿菌 Mtx1 和 Mtx2 基因克隆到質粒上,并轉入大腸桿菌中使其表達,結果發現 Mtx1 和 Mtx2具有協同毒殺作用,同時表達 Mtx1 和 Mtx2 的大腸桿菌對埃及伊蚊幼蟲的毒力是單獨表達其中一種毒素的大腸桿菌的 10 倍.
2 Cry4Ba 研究
蘇云金芽孢桿菌在形成芽孢的過程中,能夠產生多種蛋白,這些蛋白具有特異的殺蟲活性,所以又被稱為殺蟲晶體蛋白.目前,已發現 30 多種 Bt 亞種或血清型對不同種類的蚊蟲具有殺蟲活性[12].具有殺蚊活性的蛋白主要有兩類,一類為特殊的內毒素即溶細胞毒素,另一類為通常的內毒素晶體蛋白.前者主要包括 CytlA,Cyt2Ba,Cyt2Bb 和 Cyt2Bc,后者主要是Cry2Aa,Cry4A,Cry4B,Cryl0A,CryllA,CryllBa,CryllBb,Cryl9A,Cryl9B,Cry20Aa 和 Cry27A[13].
2.1 Cry4Ba 作用機理和結構
Cry4Ba 是從蘇云金球形芽孢桿菌以色列亞種中分離獲得,對伊蚊和按蚊的幼蟲具有較好的毒殺作用.Cry4Ba 合成形式為二元毒素,分子量為130 kDa.Cry 蛋白殺蟲的主要過程為:伴孢晶體在昆蟲幼蟲中腸中由于堿性消化液的作用而溶解,釋放原毒素蛋白.原毒素在中腸蛋白酶作用下進一步降解為活性毒蛋白.昆蟲中腸刷狀緣膜囊泡細胞膜表面受體與毒蛋白結合,毒蛋白寡聚化并插入中腸細胞膜形成離子通道或孔,敏感細胞的滲透平衡被破壞,導致腸道細胞發生腫脹與自溶.最終導致蚊蟲死亡[14-15].
Cry 晶體蛋白在三維結構上有很大的相似性,都是由 3 個結構域組成.2005 年 Boonserm 等[17]測得了Cry4Ba 晶體結構.Cry4Ba 的 domain I 大約由 298 個氨基酸構成,負責離子通道的形成,Cry4Ba 的 domainI 是由兩性的 α3~α7 5 個螺旋構成的螺旋束,α5 的疏水性最強.α3,α4,α6 和 α7 圍繞 α5 逆時針方向排列,N 端的 α1~α2b 由于晶體形成過程中的水解作用而缺失,α1~α2b 這 3 個螺旋對于 Cry4Ba 的毒力沒有明顯的作用.Cry 毒素的 domain Ⅱ大約是由 205個氨基酸構成,是受體結合位點,同時是 Cry 毒素殺蚊專一性和受體特異性結合的關鍵因素.Cry4Ba 的domain Ⅱ是由 3 個反向平行的 β 折疊片構成,其中2 個 β 折疊片形成希臘鑰匙拓補結構,另外一個 β折疊片與螺旋結構形成第二個希臘鑰匙拓補結構.domain Ⅱ頂端有 3 個 loops 結構,loop1 大約由 3 個氨基酸構成,loop2 大約由 4 個氨基酸構成,loop3 大約由 16 個氨基酸構成.這 3 個 loops 結構形成一個類似于免疫球蛋白的抗原決定區.Cry4Ba 的 loops 結構決定了其對庫蚊的毒力.loop 結構在決定殺蚊特異性方面起一定的作用.domain III 是由 β 折疊片構成的三明治結構,三明治結構包含一個從 C-末端β23 鏈延伸的螺旋結構.Cry4Ba 的結構和 Cry1Aa 的結構十分相似[16-17].
2.2 Cry4Ba 基因工程研究
2001 年孫釩等[18]將 Cry4Aa、Cry4Ba 和 Cry11Aa基因轉入蘇云金芽孢桿菌無晶體突變株 4Q7 中,Cry4Aa、Cry4Ba 和 Cry11Aa 基因成功表達,轉化菌株產生伴孢晶體.轉化菌株對敏感、抗性致倦庫蚊和白紋伊蚊\\(Aedes albopictus\\)幼蟲的生物測定結果顯示:
Cry4Aa、Cry4Ba 和 Cry11Aa 毒蛋白對庫蚊和伊蚊的毒力較低,二元毒素抗性庫蚊幼蟲對蘇云金芽孢桿菌殺蚊毒素蛋白無明顯的交叉抗性.同年孫釩等[19]將Cry4Ba 與二元毒素克隆在穿梭載體上,并將其轉入蘇云金芽孢桿菌無晶體突變株中,轉化菌株 Bt-BW611 成功表達 Cry4Ba 毒蛋白與二元毒素,研究發現 Cry4Ba 毒蛋白與二元毒素具有協同作用,表達Cry4Ba 與二元毒素的菌株其毒力是只表達一種毒素菌株毒力的 40 倍.2003 年 Abdullah 等[20]將 Cry4Badomain II 的 3 個 loop 結構的氨基酸替換,檢測突變體 蛋 白 對 埃 及 伊 蚊 、 四 斑 按 蚊\\(Anophelesquadrimaculatus\\)、 致 倦 庫 蚊 、 尖 音 庫 蚊\\(Culexpipiens\\)4 種蚊蟲的毒力 . loop1 和 loop2 突變后,Cry4Ba 對埃及伊蚊和四斑按蚊沒有活性;loop3 突變后,Cry4Ba 毒蛋白對致倦庫蚊和尖音庫蚊活性增大,而對埃及伊蚊和四斑按蚊的活性沒有改變,證明將短變量序列引入到 loop 結構中,可以增強 Cry 殺蚊毒蛋白的活力.2005 年 Boonhiang Promdonkoy 等[21]將Cry4Ba 和 cyt2Aa2 基因轉入到大腸桿菌中,表達Cry4Ba 毒蛋白的大腸桿菌對埃及伊蚊幼蟲具有毒殺作用,LC50為 250 ng·mL-1,但是其對致倦庫蚊的幼蟲沒有毒性.cyt2Aa2 毒蛋白對埃及伊蚊和致倦庫蚊具有中等毒力,LC50為 305 ng·mL-1和 250 ng·mL-1;共同表達 Cry4Ba 和 cyt2Aa2 毒蛋白的大腸桿菌對埃及伊蚊和致倦庫蚊幼蟲的毒力顯著提高,LC50分別為7 ng·mL-1和 20 ng·mL-1,說明 Cry4Ba 和 cyt2Aa2 毒蛋白對致倦庫蚊幼蟲具有協同作用.2006 年 Zribi等[22]從蘇云金芽孢桿菌 BUPM97 中克隆得到 Cry4Ba型基因,命名為 Cry4BLB,Cry4BLB 與之前發現的Cry4Ba 型基因有很大不同,尤其是 N-末端domain Ⅲ上的 2 個氨基酸的變化,對 Cry4BLB 特異性和毒力有很大的影響.將 Cry4BLB 基因轉入蘇云金芽孢桿菌無晶體突變株中,成功表達了 Cry 殺蚊毒蛋白,又將 Cry4BLB 轉入含有 Cry2A 基因的無晶體突變株中,發現 Cry4BLB 蛋白和 Cry2A 毒蛋白對尖音庫蚊具有協同作用.2010 年 Pablo Emiliano 等[23]研究證明cyt1Aa 可加強 Cry4Ba 的活性,實驗中發現 cyt1Aaloop 結構的 β6-αE K198A,E204A 和 β7-k225A 的突變會影響 cyt1Aa 和 Cry4Ba 的結合和協同作用.Cry4Ba SI303 -304 AA 雙突變后,發現 cyt1Aa 與Cry4Ba 的結合加強,協同作用減弱,cyt1Aa 在二者的協同作用中起關鍵作用.
3 問題與思考
近幾年來人們對 Mtx1 毒蛋白和 Cry4Ba 毒蛋白與其他毒蛋白的協同作用以及 Mtx1 毒蛋白的基因改造和 Cry4Ba 毒蛋白氨基酸的替換進行了一些研究,但在研究中還有一些關鍵性問題沒能解決,我們總結了以下幾個重要方面:\\(1\\)Cry4Ba 毒蛋白和Mtx1 毒蛋白對靶標昆蟲具有較高的特異性,在帶來安全性的同時,也導致了其殺蟲譜過窄的問題;\\(2\\)長期大量使用蘇云金芽孢桿菌和球形芽孢桿菌也將導致抗藥性的產生;\\(3\\)Mtx1 毒蛋白易被蛋白酶分解,導致其只在球形芽孢桿菌的孢子中可以檢測到,致使殺蟲效率降低;\\(4\\)Cry4Ba 毒蛋白中,不同位置氨基酸的改變對其特異性和毒力具有很大的影響,而我們對其研究程度并不精細.上述內容可作為未來研究的重點,其結果將對更好的開發利用球形芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌防治蚊蟲有積大促進作用.
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