生長分化因子（growth differentiation factor-15,GDF-15）又名 MIC-1、PDF、PLAB、PTGFB 或 NAG-1,是轉化生長因子β（TGF-β）超家族成員[1].GDF-15是一種分泌型二聚體蛋白，其基因位于19號染色體的p12.1-13.1,翻譯后的前體蛋白由308個氨基酸殘基組成，經剪切生成2條含112個氨基酸殘基的多肽鏈，再通過分子間二硫鍵形成同源二聚體的成熟形式后，分泌到胞外發揮功能[2].GDF-15高表達于胎盤和成人的前列腺組織中，而在其他組織中低表達。在病理和應激環境下，GDF-15的表達量明顯升高。多項研究表明，GDF-15不但參與免疫反應[4-5],與多種心臟疾病的診斷、預后存在相關性[3],而且與多種腫瘤的發生發展密切相關[6,7].
大量文獻表明GDF-15在許多腫瘤組織中高表達，可以作為結腸癌、前列腺癌、胰腺癌的血清早期診斷標志物[8].與其他 TGF-β超家族成員相似，GDF-15能夠通過活化細胞表面TGF-βⅠ型和Ⅱ型受體，從而募集并激活下游Smad信號通路來發揮其相應的生物學功能，可能在腫瘤發生的早期階段發揮抑瘤作用，而在晚期階段轉而促瘤[9-10].
本實驗室前期研究發現，GDF-15與腫瘤免疫逃逸密切相關[6],是潛在的腫瘤治療靶標，我們擬采用抗體特異性阻斷的方法在動物水平檢驗其靶向治療的可行性。但市售的GDF-15抗體種類少、價格高，難以滿足實驗需求。因此，在本研究中，我們通過基因工程技術構建重組融合蛋白GDF-15的原核表達系統，獲得純度較高的抗原蛋白，在此基礎上制備了高滴度的GDF-15多克隆抗體，為后續靶向治療研究的開展奠定基礎。
1 材料與方法
1.1 材料
BALB/c小鼠來自第四軍醫大學實驗動物中心；HT29、sw480、caco-2結腸癌細胞購自ATCC;大腸桿菌BL21、DH5α，pET-32a（+）載體由本實驗室提供。反轉錄試劑盒、限制性內切酶、DNA聚合酶購自TaKaRa公司；質粒提取試劑盒及膠回收試劑盒購自OMEGA公司；抗GDF-15抗體購自Abnova公司；兔抗人β-actin一抗、HRP標記的二抗購自中杉金橋公司；其他試劑均為分析純產品。據已報道的人GDF-15基因編碼區序列設計上游引物（5'-CGGGATCCATGGCGCGTGCGCG-3‘）和下游引物（5'-CCCTCGAGCTATATGCAGTGGCAGTCTTTGG-3’），由上海生工公司合成。
1.2 重組質粒pET-32a（+）-GDF-15的構建
提取人結腸癌細胞 HT29的總 RNA,反轉錄成cDNA,設計GDF-15特征性引物，體外擴增，PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳，回收克隆片段，經BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后連接到經同樣雙酶切的pET-32a（+）載體上，將連接產物用CaCl2法轉入大腸桿菌DH5α感受態細胞中，接種到含氨芐西林的LB瓊脂糖培養板中，37℃孵箱中培養12 h,篩選出陽性克隆，提取質粒進行雙酶切鑒定和測序鑒定，將構建的質粒命名為pET32a（+）-GDF-15.
1.3 重組GDF-15的誘導表達和純化
將測序正確的質粒轉化大腸桿菌BL21菌株，篩選單克隆，將含pET-32a（+）-GDF-15質粒的大腸桿菌BL21接種于含氨芐西林的LB培養基中，37℃振蕩培養，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG誘導，培養6 h后收集菌體，加入5倍SDS-PAGE上樣緩沖液，混勻煮沸 10 min,12 000 r/min 離心 5 min,SDS-PAGE鑒定GDF-15的表達。
經SDS-PAGE鑒定篩選出GDF-15高表達的菌落，誘導表達，離心收集菌體，將菌體重懸于細菌裂解緩沖液中，冰上超聲波裂解（功率300 W,超聲5s,間歇10 s），離心20 min,棄上清，用8 mol/L尿素溶解包涵體。離心后取上清進行Ni親和層析純化，以10倍柱體積的洗滌緩沖液洗滌3次，洗脫緩沖液洗脫重組蛋白并收集，SDS-PAGE 檢測純化后的GDF-15蛋白。
1.4 GDF-15蛋白的復性與鑒定
對變性的蛋白進行復性，分別用8、6、4、2 mol/L尿素和不含尿素的PBS溶液對GDF-15蛋白進行透析，每次6 h;對復性后的蛋白經SDS-PAGE鑒定相對分子質量；SDS-PAGE 后，用 300 mA 電流轉膜 1h,室溫封閉 2 h,用 1∶3000 稀釋的 GDF-15一抗于4℃孵育過夜，用 1∶5000 稀釋的二抗于室溫孵育 1h,Western印跡鑒定是否為GDF-15蛋白。
1.5 GDF-15多克隆抗體的制備
將純化的蛋白用PBS稀釋并與等量完全弗氏佐劑混合，充分乳化后，經皮下多點注射免疫6~8周齡雄性BALB/c小鼠（80 μg/每只）；2周后，將蛋白與等量不完全弗氏佐劑混合，充分乳化后加強免疫；每2周加強免疫一次，末次免疫14 d后取血，分離血清，分裝后-20℃保存備用。
1.6 GDF-15多克隆抗體效價檢測
采用間接 ELISA 檢測抗體滴度。用 100 ng/200 μL GDF-15包被酶標板，4℃過夜后棄掉液體，加入 5 mg/L BSA 封閉緩沖液（0.1 mol/L NaHCO3,pH8.6）于37℃封閉2 h;傾去液體，用TBST（1 mL/LTween-20,TBS）洗 5次，每次 2 min;每孔加入 HRP標記的小鼠二抗抗體（1∶5000）100 μL,37℃孵育 1h;用 TBST 洗 3 次，加入 OPD 顯色液，37℃顯色 15min;加入 2 mol/L 硫酸終止反應，用酶標儀測定D490nm值，P/N大于2.1為陽性，設立陰性對照為無關蛋白包板。
1.7 GDF-15多克隆抗體特異性鑒定
取人結腸癌細胞sw480、caco-2,加入強效裂解液，冰上裂解 1 h,4℃、12 000 r/min 離心 20 min,BCA法定量蛋白濃度，加入5倍上樣緩沖液煮沸10min,經常規 SDS-PAGE 后濕轉至 PVDF 膜上，用5% BSA室溫封閉 1 h,加入 1∶500稀釋的抗血清，4℃孵育過夜，洗滌后用 1∶5000稀釋的辣根酶標記的抗鼠二抗室溫孵育1 h,洗滌后ECL顯色，壓片，保存結果。
2 結果
2.1 GDF-15 cDNA片段的擴增及重組質粒的制備
用特異的上下游引物從結腸癌細胞 HT29 的cDNA中擴增出GDF-15基因，PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳結果見圖1,擴增片段約350 bp.將目的基因插入pET-32a（+）載體，構建重組質粒，用限制性內切酶BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切pET-32a（+）-GDF-15,也在約 350 bp 處可見 GDF-15 特異性條帶（圖2），與預期結果一致。將獲得的pET-32a（+）-GDF-15質粒測序，結果正確，說明重組質粒構建成功。
2.2 GDF-15蛋白的誘導表達及純化
將轉化pET-32a（+）-GDF-15質粒的大腸桿菌BL21培養后用 1 mmol/L IPTG 誘導 6 h,用全菌進行 SDS-PAGE,結果見圖 3,經 IPTG 誘導后在 Mr約28×103處出現明顯的表達產物條帶。超聲波裂菌后，上清液經Ni親和層析柱純化，250 mmol/L咪唑洗脫獲得目的蛋白峰（圖 4），PBS 透析后行 SDS-PAGE,顯示蛋白條帶位置正確、純度較好（圖5）。
2.3 GDF-15蛋白的鑒定
將純化的蛋白行Western印跡檢測，結果顯示原核表達的 GDF-15 融合蛋白能夠被特異性抗體識別，抗原性良好（圖6）。
2.4 GDF-15多克隆抗體的制備和效價檢測
將純化的 GDF-15蛋白混合弗氏佐劑，皮下多點注射免疫BALB/c小鼠，進行1次基礎免疫和3次加強免疫，末次免疫后14 d取血，分離血清，ELISA檢測抗血清效價達1∶100 000（圖7）。
2.5 GDF-15 多克隆抗體檢測腫瘤細胞內源性GDF-15的表達
以人結腸癌細胞系sw480、caco-2為檢測對象，采用本實驗制備的GDF-15抗體進行檢測。結果顯示，抗體能夠檢測到胞內GDF-15,產生特異性條帶（圖8），說明GDF-15抗體制備成功，可應用于后續研究工作中。
3 討論
GDF-15在調控細胞應激反應、炎癥反應及成體急性損傷修復過程中發揮著重要作用[11],而在腫瘤發生和發展中的功能研究尤為人們關注。針對前列腺癌、乳腺癌和結腸癌的研究顯示，GDF-15在血清中的含量與腫瘤組織惡性程度、細胞的增殖和轉移能力都存在明顯的相關性。還有文獻報道，GDF-15能夠介導腫瘤誘發的消瘦和厭食癥。不僅說明循環系統中的GDF-15水平可以作為腫瘤診斷和預后的標志，而且這些表達于腫瘤細胞內的GDF-15也是腫瘤治療的潛在靶點。
為了用抗體封閉GDF-15,以研究其在腫瘤中的功能及其靶向藥物的應用前景，我們首先要獲得大量的抗原蛋白。目前市售的GDF-15多為CHO細胞表達，成本高，生產周期長。因此，我們將人GDF-15序列克隆至原核表達載體pET-32a（+）中，構建了重組表達質粒，并建立了經濟、高效的GDF-15原核表達系統。在此基礎上，我們用傳統方法制備了高滴度的GDF-15多克隆抗體，通過Western印跡檢測了結腸癌細胞 sw480、caco-2中 GDF-15的表達，表明我們制備的抗體能有效識別人源GDF-15分子。以上結果為我們后續研究GDF-15靶向治療及其生物學功能和信號傳導通路奠定了基礎。
參考文獻
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