水稻是世界上最重要的糧食作物之一，為全 球一半以上人口提供糧食來源[1].水稻是亞熱帶起源作物，比小麥和大麥更容易受到低溫的影響。近年來，由于全球氣候變化異常，極端氣候發生頻繁，低溫冷害已成為水稻生產中的主要限制因素之一。因此，培育耐冷水稻品種具有十分重要的現實意義。

植物耐冷性大多是受多基因控制的復雜性狀，而且還會與其他環境脅迫因子發生交叉作用，耐冷機理復雜，從而導致傳統育種方法在改良植物耐冷性方面受到限制。利用現代分子生物技術發掘利用優異的基因資源來改良植物的耐冷性，是提高植物耐冷豐產能力最為有效的途徑。目前，低溫信號轉導途徑主要分為依賴 CBF（ CRT/DRE binding factor） 的信號轉導途徑和不依賴 CBF 的信號轉導途徑。在依賴 CBF 的信號轉導途徑中，細胞首先通過改變膜的流動性和蛋白構象接受冷信號，并且激活 Ca2 +通道，Ca2 +受到低溫誘導濃度瞬時增加，使信號轉導途徑中的CBF 上調表達，進而調控其下游低溫脅迫相關功能基因表達上調[2 -3].在不依賴 CBF 的信號轉導途徑中，下游低溫脅迫相關功能基因的表達受到 CBF 之外的轉錄因子（ MYB,SNAC 等） 或其他因素（ 例如 ABA） 的誘導，對該途徑的研究沒有依賴 CBF 的信號轉導途徑系統、全面、深入。根據低溫信號轉導途徑，本文從蛋白激酶（ CDPK,MAPK 等） 基因、轉錄因子（ ICE1 / ICE-like,CBF /DREB,MYB 等） 基因、功能基因（ 合成滲透調節物質基因、脂肪酸去飽和代謝關鍵酶基因等） 三方面詳細闡述耐冷基因在水稻耐冷基因工程育種中的最新研究進展，以期為耐冷基因的利用及農作物耐冷遺傳改良和育種提供參考。

1 感應和轉導脅迫信號的蛋白激酶和其他蛋白酶類基因

蛋白激酶位于脅迫信號轉導的上游，在感受外界刺激、參與信號傳遞、增加蛋白質合成及調控轉錄等方面起重要作用[4],其主要包括鈣依賴蛋白激酶（ calcium-dependent protein kinase,CD-PK） 、絲裂原活化蛋白激酶（ mitogen-activated pro-tein kinase,MAPK） 等。

水稻 OsCDPK7 基因受冷、高鹽誘導表達，在水稻中組成型超表達 OsCDPK7 基因，與非轉基因植株相比，正常條件下轉基因植株苗期的生長發育狀況沒有發生明顯改變，但苗期的耐冷、耐鹽和抗旱能力增強，并且轉基因植株對脅迫的耐受能力與 OsCDPK7 基因的表達水平呈正相關[5].水稻 OsCDPK13 基因受冷和 GA3誘導表達，但干旱和鹽脅迫可以抑制該基因的表達，在水稻中組成型超表達該基因，與空載體轉化植株相比，正常條件下轉基因植株的株高沒有明顯變化，低溫脅迫處理后轉基因植株的存活率顯著提高； OsCDPK13 基因的 RNAi 試驗結果表明，轉基因水稻的株高變矮，耐冷性降低[6].水稻 Os-MAPK5 基因受多種生物（ 病原侵染） 和非生物脅迫（ ABA、干旱、高鹽、低溫） 誘導表達，在水稻中組成型超表達該基因，與空載體轉化植株相比，正常條件下轉基因植株的表型沒有明顯變化，但轉基因植株苗期的抗旱、耐鹽、耐冷性增強； Os-MAPK5 基因的 RNAi 試驗結果表明，正常條件下轉基因水稻在營養生長后期出現不規則條紋，但仍能結實，轉基因植株苗期的抗旱、耐鹽、耐冷性降低，兩個試驗結果均表明 OsMAPK5 基因正調控水稻的抗旱、耐鹽、耐冷性[7].另外，水稻 CIPK（ calcineurin B-like protein-interacting protein kinase）家族基因功能多樣，參與多種非生物脅迫響應，其中 OsCIPK03 受低溫強烈誘導，受 ABA 輕微誘導，不受干旱、高鹽誘導，在水稻中組成型超表達該基因，與野生型植株相比，正常條件下轉基因植株的生長發育沒有發生明顯變化，但低溫脅迫處理后轉基因植株苗期的存活率顯著提高，一定程度上是因為低溫脅迫條件下轉基因植株體內脯氨酸和可溶性糖含量顯著升高，脯氨酸合成酶基因及脯氨酸轉運蛋白基因的表達量提高[8].

2 轉錄因子

植物低溫脅迫過程中存在多層次的轉錄調控，最上游直接受低溫誘導的轉錄因子是 ICE（ inducer of CBF expression） ,它在常溫下以非活性形式存在，受低溫激活后其可誘導 CBF/DREB1（ C-repeat binding factor/dehydration-responsive el-ement binding protein 1） 基因的轉錄，從而提高植物耐寒性[9].ICE1 基因編碼一個 MYB 類型的堿性螺旋-環-螺旋（ bHLH） 轉錄因子，低溫脅迫下，ICE1 結合在 CBF3 啟動子區的 MYC 順式作用元件上，激活 CBF3 基因的表達[9] .將擬南芥 ICE1 基因在水稻中組成型超表達，在低溫處理下轉基因植株苗期的死亡率（ 10% ~ 50%） 較非轉基因植株（ 80%） 顯著下降，脯氨酸含量顯著升高（ 2. 12 ~ 2. 23 倍） ,表明超表達擬南芥 ICE1基因提高了水稻的耐冷能力[10].

CBF / DREB1 亞家族轉錄因子屬于 AP2 / ERF家族，在低溫誘導中起關鍵作用[11 -12],可與CRT / DRE （ C-repeat / dehydration responsive ele-ment） 結合，不需要低溫刺激便能激活一系列啟動子區域含 CRT/DRE 元件耐冷基因的表達，如COR（ cold regulated） ,HOS（ high expression of os-motic responsive） ,KIN（ cold inducible） ,LTI （ low-temperature induced） ,RD （ responsive to dehydra-tion） 等基因的表達[13 -16],從而提高植物的耐冷性。研究 發 現，CBF3,CBF1,CBF2 分 別 對 應DREB1A,DREB1B,DREB1C,均受低溫誘導[12].

在擬南芥中，CBF4 基因與 CBF1,CBF2,CBF3 不同，其能被 ABA 和干旱脅迫誘導表達但不受低溫脅迫的誘導，說明 CBF4 及其目的基因的表達是依賴 ABA 信號轉導途徑的[17]; 但在大麥中，CBF4 基因也受低溫誘導，在水稻中超表達該基因可以提高植株的耐冷、耐鹽、抗旱性，且不影響植株的正常發育，但 CBF4 調控的基因大部分與CBF3 / DREB1A 不同[18].在水稻中分離的 CBF同源 基 因 OsDREB1A,OsDREB1B,OsDREB1C,OsDREB1D,OsDREB2A 中 OsDREB1A,OsDREB1B受低溫誘導，OsDREB2A 受干旱和高鹽誘導[19].在水 稻 中 超 表 達 擬 南 芥 CBF1 或 水 稻 自 身DREB1 / CBF 基因，雖然影響了轉基因植株苗期的生長發育（ 矮?。?,但提高了植株可溶性糖與脯氨酸含量，增強了植株的耐鹽、抗寒能力[20 -21].

同樣地，將水稻 OsDREB1A 基因轉入擬南芥中，轉基因擬南芥對干旱、高鹽和低溫的耐受能力增強，說明 CBF 途徑在單子葉與雙子葉植物中有著保守的模式[19].在旱稻中克隆了一個 OsDREB1F基因，其受高鹽、干旱、低溫和 ABA 誘導，其不但能激活啟動子中含有 CRT/DRE 核心序列的 COR基因的表達，還能激活 rd29B、RAB18 基因的表達，說明 OsDREB1F 基因也參與了 CBF 和 ABA信號轉導過程； 在水稻和擬南芥中超表達 Os-DREB1F 基因，正常條件下轉基因水稻和擬南芥幼苗與野生型植株無明顯表型差異，但轉基因植株的耐冷、耐鹽、抗旱能力均增強[22].

除 ICE,CBF/DREB1 外，還有一些轉錄因子參與冷脅迫信號轉導，調控耐冷基因的表達，如MYB、鋅指蛋白、SNAC、WRKY 等。 在植物中，MYB 是一個大的轉錄因子家族，其家族基因參與各種非生物脅迫。研究發現，水稻 OsMYB4 基因只受低溫脅迫誘導，瞬時表達試驗證明 MYB4 轉錄激活 PAL2,ScD9,SAD,COR15a 冷誘導啟動子，超表達 OsMYB4 基因可提高轉基因擬南芥、番茄、蘋果的耐冷凍性，在轉基因植株中，MYB4 影響不同低溫誘導途徑中低溫脅迫響應基因的表達，說明它在耐冷中起著控制開關的作用[23 -25].Os-MYB2 基因受冷、高鹽、脫水誘導表達，在水稻中組成型超表達該基因，正常條件下轉基因植株的表型同野生型植株沒有明顯差異，但轉基因植株苗期的耐冷、耐鹽、抗脫水性增強，在脅迫條件下，轉基因植株體內脯氨酸和可溶性糖含量及一些脅迫相關基因的表達量提高，H2O2和 MDA 含量降低[26].水稻 MYBS3 參與各種非生物脅迫，在水稻中其主要調控冷脅迫，超表達 OsMYBS3 基因，在溫室條件下與野生型植株相比轉基因植株生長矮小、穗數減少、開花推遲，但在大田條件下兩者的表型和結實率無明顯差異，且轉基因植株苗期的耐冷性增強； OsMYBS3 參與一條不同于CBF / DREB1 的信號轉導途徑，其抑制了依賴于CBF / DREB1 的信號轉導途徑，MYBS3 響應低溫脅迫較慢，而 CBF/DREB1 響應低溫脅迫較快，這兩條不同的冷脅迫信號轉導途徑在水稻中呈先后順序且互補地調節冷脅迫信號[27].超表達OsMYB3R-2 基因，可以提高低溫處理下水稻的脯氨酸含量，增強水稻的耐冷能力，功能分析表明OsMYB3R-2 是通過改變細胞周期和下游抗逆基因的異位表達來調節低溫脅迫的[28].鋅指蛋白是一類具有手指狀結構域的轉錄因子，在基因表達調控、細胞分化、增強植物抗逆性等方面具有重要作用。將水稻冷誘導鋅指蛋白 OsCOIN（ coldinducible） 基因在水稻中組成型超表達，提高了轉基因植株中 P5CS（ Δ1-pyrroline-5-carboxylate syn-thetase） 基因表達水平和脯氨酸含量，增強了轉基因植株苗期的耐冷、抗旱、耐鹽性[29].秈稻中的具有 A20/AN1 鋅指結構域的脅迫相關蛋白（ stress associated protein,SAP） 基因 OsiSAP8 受冷、熱、高鹽、重金屬等各種脅迫誘導，將其在水稻中組成型超表達，轉基因植株在萌發階段和苗期均 表 現 出 較 強 的 耐 冷、耐 鹽、抗 旱 性[30].

WRKY 是植物特異鋅指轉錄因子，在植物防御反應方面具有重要作用。在水稻中超表達 Os-WRKY76 基因，提高了植株細胞膜穩定性和過氧化物酶（ POD） 等非生物脅迫相關基因的表達水平，增強了轉基因植株的耐冷性[31].NAC（ NAM,ATAF 和 CUC） 家族轉錄因子也與多種脅迫有關，是植物特異轉錄因子家族，在水稻中發現了 140 個 NAC 基因[32],但僅一少部分被深入研究，這些基因大多參與調控植物生長發育及脅迫響應，其中 SNAC2（ stress-responsive NAC 2） 基因與冷脅迫相關。組成型超表達旱稻 SNAC2 基因，可提高轉基因水稻的細胞膜穩定性和耐冷、耐鹽、抗脫水能力，且顯著提高轉基因水稻對ABA 的敏感性，并且在轉基因植株中，被 SNAC2激活的脅迫響應基因與其他 NAC 基因完全不同[33].

除了上述正調控植物耐冷性的轉錄因子外，還有一些負調控植物耐冷性的轉錄因子，如 Os-WRKY45-1,OsWRKY45-2,TCP （ TB1 / CYC / PCF） ,通過基因敲除或者基因沉默技術可以剔除該類轉錄因子基因或者降低其表達量，從而提高植物的耐冷性。OsWRKY45-1,OsWRKY45-2 是等位基因，分別來自粳稻、秈稻，兩者均負調控植物的耐冷性和抗旱性，在水稻中分別組成型超表達兩基因均降低了植株的耐冷性、抗旱性，而敲除 Os-WRKY45-1 基因的水稻植株和 OsWRKY45-2-RNAi水稻植株的耐冷性和抗旱性均增強[34].TCP 轉錄因子是含有 bHLH（ basic helix loop helix） 的植物特異轉錄因子家族，參與多種生理生化過程，具有重要的調控作用。研究發現，一些 TCP 轉錄因子負調控植物的耐冷性，如 OsPCF6,OsTCP21,通過 RNAi 技術沉默水稻 OsPCF6,OsTCP21 基因，提高了轉基因水稻幼苗體內脯氨酸含量，降低了 H2O2含量，增強了水稻幼苗的耐冷性，且轉基因水稻幼苗在正常條件下與野生型植株及超表達該基因的轉基因水稻在表型上無明顯差異[35].OsPCF6,OsTCP21 是 MicroRNA319 的靶基因，在水稻中超表達 MicroRNA319 基因同樣提高了轉基因植株的耐冷性[35].

3 功能基因

植物遭遇低溫脅迫時會通過誘導合成滲透調節物質來維持滲透壓平衡，從而避免低溫傷害，這類滲透調節物質主要包括脯氨酸、甜菜堿、海藻糖、果聚糖等。水稻中合成脯氨酸的關鍵酶基因 OsP5CS2 經 T-DNA 插入喪失功能后，與野生型植株相比，突變體對鹽、冷敏感，經高鹽、低溫處理后生長遲緩，表明 OsP5CS2 對提高植物耐冷、耐鹽性十分重要[36].甘氨酸甜菜堿合成所涉及的酶包括膽堿單加氧酶（ choline monooxygen-ase,CMO） 、甜菜堿脫氫酶（ betaine aldehyde dehy-drogenase,BADH） 、膽堿氧化酶（ choline oxidase,COD） 、甘氨酸肌氨酸甲基轉移酶（ glycine sarco-sine methyltransferase,GSMT） 、肌氨酸二甲基甘氨酸甲基轉移酶（ sarcosine dimethyglycine methyl-transferase,SDMT） .在水稻中超表達 CodA 基因可提高水稻的耐冷和耐鹽性[37].同時將鹽生隱桿藻的 ApGSMT 和 ApDMT 基因在水稻中組成型超表達，提高了水稻體內甘氨酸甜菜堿含量，增強了植株苗期的耐冷、耐鹽性[38].海藻糖-6-磷酸合成酶（ TPS） 和海藻糖-6-磷酸磷酸酯酶（ TPP）是大腸稈菌中海藻糖合成的關鍵酶，將兩個關鍵酶基因融合獲得 TPSP 基因，在水稻中組成型超表達該融合基因可提高植株體內海藻糖含量，增強植株苗期的耐冷、抗旱、耐鹽性，但并沒有延緩植株的生長[39 -40].將水稻中的 OsTPS1 基因在水稻中組成型超表達，提高了轉基因植株體內的海藻糖、脯氨酸含量及一些脅迫相關基因的表達量，增強了植株苗期的耐冷、耐鹽、抗旱性，但并沒有顯著改變植株的表型[41].另外，將小麥果聚糖合成酶基因 WFT2 在水稻中組成型超表達，同樣也提高了植株體內的果聚糖含量，增強了植株苗期的耐冷性，且果聚糖含量與耐冷性程度呈正相關[42].生物膜是低溫冷害作用的首要部位，而且低溫傷害的原初反應發生在生物膜系統類脂分子的相變上[43].許多研究指出，植物的相變溫度越低，其抗寒性越強，降低植物的膜相變溫度，植物的抗寒性也得到提高； 而膜脂中的類脂和脂肪酸成分的不飽和度明顯影響著膜脂的相變溫度，不飽和度越高，植物的抗寒性越強[44 -46].脂酰甘油（ PG） 具有較多的飽和脂肪酸，是決定膜脂相變的主要因素，而甘油-3-磷酸?；D移酶（ glycerol-3-phosphate acyltransferase,GPAT） 又是PG 生物合成過程中的第一個?；セ?，對決定植物膜 PG 的不飽和度起關鍵作用[47].在水稻中超表達擬南芥 GPAT 基因，可提高苗期轉基因植株葉片中不飽和脂肪酸含量及光合速率，增強植株的抗寒性[48].將擬南芥和菠菜的 AGPAT和 SGPAT 基因分別轉入水稻后發現，在低溫條件下苗期轉基因植株葉片中的磷脂酰甘油的順式不飽和脂肪酸含量增加，光合速率明顯提高，生長速度加快，耐冷性增強[49].

除上述功能基因外，還有一些基因在提高水稻耐冷性方面具有重要作用，如活性氧清除酶類基因等。將水稻谷胱甘肽-S-轉移酶 OsGSTL2 基因在擬南芥中組成型超表達，提高了轉基因擬南芥的 GST 活性（ 為野生型植株的 3 ~ 7 倍） ,增強了轉基因擬南芥對重金屬、冷、鹽、滲透脅迫的耐性，且正常條件下，在蓮座期前轉基因擬南芥與野生型植株在表型上沒有差異，說明超表達 OsG-STL2 可提高植株的耐冷性，有望在水稻耐冷基因工程中應用[50].另外，水稻液泡 H+轉移無機焦磷酸酶 OVP1 是一個電致質子泵，該基因受低溫誘導表達，將其在水稻中超表達，正常條件下轉基因植株苗期與野生型植株在表型上沒有明顯差異，但在低溫條件下轉基因植株的細胞膜完整性程度和脯氨酸含量提高，MDA 含量降低，耐冷性增強[51].Ran（ Ras-like nuclear protein） 是真核細胞中含量極豐富的小分子的 GTP 酶，在植物發育、環境響應方面具有重要的作用。OsRNA2 受低溫誘導表達，不受高鹽、干旱誘導表達，根細胞有絲分裂指數與 OsRNA2 基因表達水平密切相關，在水稻中組成型超表達 OsRNA2 基因，可促進低溫脅迫條件下完整核膜的形成，有效維持細胞分裂，增強植株的耐冷性[52].OsRNA1 受低溫和吲哚乙酸誘導表達，同樣不受高鹽、干旱誘導表達，在水稻中組成型超表達 OsRNA1 基因，同樣可促進低溫脅迫條件下完整核膜的形成，有效維持細胞分裂，提高植株脯氨酸和可溶性糖含量，增強植株的耐冷性[53].

4 展望

近年來全球氣候逐漸變暖，極端氣候變化頻率增加，冷熱不均，造成低溫災害發生頻率增加，因此，提高水稻耐冷能力在維護農業高產穩產、農業可持續性發展及保障糧食安全方面具有越來越重要的作用。為了克服低溫對水稻的不利影響，達到增產穩產的目的，除了采取其他農業措施外，篩選和選育強耐冷性水稻種質資源，挖掘強耐冷性基因，然后通過基因工程技術提高水稻耐冷性是有效的途徑。

目前，水稻耐冷基因工程研究已從蛋白激酶、轉錄因子、滲透調節物質、脂肪酸去飽和代謝關鍵酶基因等方面取得了一定的進展，具有潛在的應用前景。但該領域還存在一些亟待解決的問題： （ 1） 耐冷性大多是受多基因控制的數量性狀，水稻高抗寒性的表現往往需要一系列相關基因的共同表達，通過轉單個耐冷基因獲得的轉基因植株的耐冷性增強幅度有限，故今后應該進行轉多個耐冷基因尤其是調節基因的系統研究。

但目前，同時轉化多個基因的技術還不成熟，此方面有待進一步深入研究。（ 2） 轉基因植株的耐冷性鑒定大多是在苗期進行的，植株苗期耐冷不代表其他生育時期也耐冷，尤其是對產量影響較大的抽穗期-灌漿期，故需要同時進行苗期和抽穗期-灌漿期的耐冷性鑒定，這樣才能獲得在低溫條件下既不影響生長發育又能保證產量的轉基因耐冷植株。（ 3） 轉基因植株的耐冷性鑒定大多是在室內或培養箱等可控條件下進行的，這與大田自然冷害有所不同，因此在兩種條件下表現的耐冷性可能會有所不同，故建議轉基因植株的耐冷性鑒定進一步在田間進行，以確定轉基因植株的耐冷性。（ 4） 耐冷目的基因大多是采用組成型強啟動子驅動的，雖然能夠提高轉基因植株的耐冷性，但有時會影響轉基因植株的生長發育，最終可能會影響到產量，因此，在今后的研究及實際應用中建議使用脅迫誘導型啟動子驅動耐冷目的基因以提高轉基因植株的耐冷性。

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