1 植物耐熱性的研究背景

植物在生長發育過程中會受到各種非生物脅迫的影響，其中溫度對植物生長發育的影響尤其嚴重.由于氣候改變地球的平均溫度正在上升，這意味著在很長一段時期內位于不同地域的植物將遭受高溫脅迫的擔憂會變為現實（Grover et al., 2013）。高溫是植物經常遭受的主要環境脅迫之一，會影響植物的各種生理生化過程，如抑制光合作用、改變細胞膜穩定性、改變激素和次級代謝物的合成、引起氧化脅迫，使活性氧對膜系統造成損傷從而傷害植物，甚至導致植物死亡（鄧朝軍等， 2012）；同時高溫也是限制農作物產量的一個重要因素，由于大多數植物的某些生長時期對高溫較敏感，所以在開花期等特殊時期的高溫會引起糧食作物產量下降.盡管事實上植物具有自身進化和應對溫度波動的能力，例如當溫度高于環境溫度 5℃~10℃時，植物就會產生熱激反應（Heat shock response），在數小時內迅速獲得耐熱性，以抵御致死高溫（鞠冠華等， 2012），但是植物的適應能力卻遠遠敵不過全球變暖的速度。因此培育耐熱性植物至關重要.讓農作物在溫室中生長的技術解決方案并不是最經濟可行的選擇。利用常規育種方法繁育耐高溫等抵抗非生物脅迫的植株并不十分成功.原因很多，主要有：

（1）耐非生物脅迫是由多基因控制，并且運用傳統育種方法獲得復雜性狀是比較困難的；（2）抗性有關的重要基因在相兼容品種間既不已知也不可用（Grover et al., 2013）。由于傳統育種在植物提高耐熱性上沒有突破性的進展，從基因水平上提高植物的耐熱能力成為一種新的研究趨勢。在 20 世紀 90 年代初，就已經有研究利用基因改造的方法解決環境脅迫對于生物的影響，Murata （1983）將擬南芥或葫蘆的脫氫酶基因在番茄中過表達實現了番茄耐低溫.

近年來，有很多關于利用轉基因方法實現耐環境脅迫的研究，關于通過轉基因方法來提高植物耐熱性的研究也屢見不鮮.例如過量表達轉錄因子OsbZIP60提高了水稻的耐熱性和耐旱性（喻旭等, 2011）;轉基因苜蓿在啟動子rd29A （水脅迫誘導的啟動子）的控制下，通過過表達酵母菌TPS1-TPP2基因改善植物生長、生物量和高溫耐受性（Suárez et al., 2009）；轉基因西紅柿過表達單去氫抗壞血酸還原酶能夠增強其對高溫脅迫和氧化應激的耐受性（Li et al., 2010）；轉基因擬南芥過表達 OsDREB2B 可增強目標基因 DRE-B2A 的表達，并能提高擬南芥耐熱性（Matsukura etal., 2010）等，這都證明轉基因技術在減緩環境脅迫傷害的方面具有明顯的優勢.

2 提高植物耐熱能力的途徑

目前，提高植物耐熱性主要是利用操控熱激應答（heat shock response, HSR）元件解決植物耐熱。提高植物耐熱能力的其分子機制是：基因工程方法直接調節 Hsp 的表達水平；調節細胞滲透性；利用細胞解毒機制和改變細胞膜流動性（Grover et al., 1998;Burke and Chen, 2006）。

這也是當前轉基因植物提高耐熱性的四個基本途徑。

2.1改變熱激蛋白來提高植物耐熱能力

當植物處于比環境溫度高 5℃~10℃時，植物就會產生熱激應答.在高溫脅迫環境中，植物的細胞代謝和生理代謝都會具有特征性.通過植物自身的特征反應，植物表現出耐熱抗性.Ritossa （1962）早在1962 年第一次揭示了熱激應答的分子原理。從 20 世紀80 年代開始，有研究人員就已經指出在植物的熱激反應，植物關閉了自身蛋白合成的基因，開啟了特異的基因，這些基因合成了新的蛋白，這些新的蛋白賦予植物耐熱性，被稱為熱激蛋白（heat shock protein,Hsp）,隨后研究人員在幾乎所有的生物中都發現了熱激蛋白（Barnett et al., 1980）。

擬南芥、玉米、番茄、水稻和小麥中都證明了熱激蛋白的存在。根據熱激蛋白的分子量把分為高分子量和低分子量兩大類。這些熱激蛋白的表達量也是不固定的，隨著環境的變化而變化。在脅迫條件下小熱激蛋白含量可以達到細胞總蛋白的 1% （Agarw-al et al., 2003）。在過去的 30 年里，研究人員對熱激蛋白進行了深入的研究，包括生理、生化和細胞與分子特性（Vierling, 1991; Agarwal et al., 2001; 2003; Kati-yar-Agarwal et al., 2001; Scharf et al., 2001）。

熱激蛋白在不同的物種之間有高度保守（Katiyar-Agarwal et al.,2001）。

為了研究熱激蛋白的詳細特性，Wang等（2004）和Kotak等（2007）對熱激蛋白的的幾個重要方面：（a）分子質量；（b）誘導物；（c）蛋白的表達位置；（d）表達模式；（e）在野生條件下的合成；（f）細胞水平；（g）對保守的氨基酸序列等進行了深入的研究.

研究結果表明，植物除了在熱激條件下表達HSPs外，重金屬、水脅迫、高鹽濃度、損傷、寒冷、缺氧等脅迫都會引起植物表達熱激蛋白。

有研究證明，植物在熱處理后或具有熱順應性，會比沒經過處理的植株更耐熱，這種現象被叫做獲得性耐熱（Senthil-Kumar et al.2007）。耐熱和獲得性耐熱都是以熱激蛋白作為熱脅迫的保護蛋白.近年來，分離、測序和克隆了大量的熱激蛋白基因（Agar-wal et al.2003）。從大量不同物種中獲得熱激蛋白基因增加了熱激蛋白的多樣性，增加了熱激蛋白的多樣分類類型。對擬南芥和水稻的基因組測序信息進行生物信息學分析發現有大量的不同的HSP 基因家族信息（Krishna and Gloor, 2001）。

熱激蛋白在調節植物耐熱功能控制方面有著重要的作用.一些研究人員通過調節熱激蛋白在微生物中的表達水平，證明小熱激蛋白同樣具有耐熱功能，本文選取三個有針對性的研究結果來對其進行闡述.Yeh 等（2002）通過在微生物中過表達水稻中的Oshsp16.9使得轉化后的大腸桿菌具有耐熱性.為了確定Oshsp16.9功能結構的位置，研究人員在大腸桿菌中構建了小熱激蛋白的缺失突變體，同時對其過表達.研究中發現，缺失了氮端 30 到 36 個殘基或者保守結構的突變體，Oshsp16.9失去分子伴侶的活性，同時，大腸桿菌也不再耐受 47.5℃。在熱激條件下漸漸的改變Oshsp16.9蛋白突變體證明氮端 30 到 36 個殘基或者保守結構的 73 到 78 對 Oshsp16.9 起著穩定性的作用，并且該保守結構和未折疊的蛋白如檸檬酸鈉酶相互作用（Yeh et al., 2002）。GST-N74E73K和GST-N74E74K 兩個 Oshsp16.9 的突變體表明 73 和74 是底物的重要結合位點（Yeh et al., 2002）。Yeh 等（1997）為了研究其耐熱能力利用 pGEX-2T 表達載體將Oshsp16.9導入到E. coli給予環境脅迫，在 47.5℃下，E. coli XL1-bluecells 由于重組質粒含有通過人工修飾的載體轉化有谷胱甘肽 S 轉移酶和 Oshsp16.9的融合基因，因此可以存活，而與轉化有 pGEX-2T載體的 pGST cells 對比，對照細胞死亡。對兩個菌株的細胞提取物在55℃下進行變性對比，pGST-FL菌株的蛋白的變性數目比pGST cells少50%.

同樣的結果在融合部分Oshsp16.9氮端78殘基，但在碳端的108沒有得到相同的結果（Yeh et al., 1997）。Pike等（2001）研究了在Synechococcus sp. PCC7942中表達的小熱激蛋白在獲得性耐熱和轉基因耐熱中的所起的作用.有三個與sHSP同源性最低的基因，分別是OsHsp源自水稻細胞質，tom111源于番茄葉綠體，6803 Hsp源自Synechocystis sp. PCC6803都被轉化到E. coli同時過表達.研究發現表達的 sHSP 的熱激蛋白能保護蘋果酸酶不被熱聚合；同樣，可以保護一些可溶性蛋白，例如：Synechococcus sp. PCC7942 中的藻青蛋白（Pike et al. 2001）。

Hsp 表達量的多少直接對植物的耐熱性產生了不同的影響，可以通過反義和RNAi 的方式調節熱激蛋白的表達量實現對植物耐熱水平的調節。玉米和擬南芥的突變體中分別下調表達的Hsp100 蛋白，其誘導耐熱能力降低（靳遠祥和陳玉銀， 2002）。Yang等（2005）研究表明，對番茄的 Hsp100/ClpB 基因沉默后番茄的耐熱能力減弱。擬南芥獲得性耐熱是通過影響反義Hsp70 來進行調節的，研究發現，缺少熱激蛋白的突變體或者 RNAi 的植株即使經過熱預處理，在熱脅迫中仍然沒有表現出耐熱性（李競蕓等， 2007;裴華麗等, 2007）。Charng 等（2006）發現下調 HsfA2 導致突變體對高溫更敏感了.研究還發現脫水應答元件結合蛋白或碳端重復結合蛋白（Dehydration Res-ponsive Element Binding protein, DREB/C-repeat Bin-ding Protein, CBF family）是轉錄調節蛋白，這些調節蛋白的功能包括耐干旱、耐鹽脅迫、抵耐寒冷。近來研究表明，在擬南芥中DREB 是高溫誘導和熱激應答的一個調控蛋白.Matsukura 等（2010）研究發現：HsfA3在熱激的條件下被誘導與DREB2A有密切的關系.相反地，通過上調表達Hsp 提高了植物耐熱性。

有研究學者通過轉基因胡蘿卜細胞株并過量表達sHsp17.7,經修飾表達的sHsp17.7植株可以在高溫脅迫下存活（吳瑩和徐香玲， 2005; Zhou et al., 2012）。

郭尚敬等（2006）種植轉有過表達 sHsp 的煙草，發現轉化的籽苗子葉打開速度明顯加快。在水稻種中過表達Oshsp17.7不僅提高了水稻的耐熱能力，也提高了對紫外線的抵耐能力（Murakami et al., 2004）。轉化有Lehsp基因的煙草在 48℃時的耐熱能力高于轉有反義構建的轉化植株（黃冰艷等， 2005）。在轉基因植物中，熱激蛋白的表達通常是過量表達。Queitsch 等（2000）在擬南芥轉基因植株中過量表達修飾AtHsp100可以使轉基因植株在45℃的熱脅迫中存活1 h,當去除熱脅迫后可恢復正常狀態，而轉化空載體的對照植株在熱處理后不能再正常生長.在水稻中過表達AtHsp100蛋白.同樣，轉化有AtHsp100基因的植株能夠在熱處理后恢復正常生長，而對照未轉化植株不能恢復到與轉化植株相似的生長狀態（Katiyar-Agarwal et al., 2003）。

2.2改變植物Osmolytes來提高植物耐熱能力

有研究表明，熱激元件和熱激轉錄因子蛋白相互作用可以提高熱激蛋白基因的轉錄量（Wu, 1995）。

近幾年，在轉基因實驗中通過熱激蛋白轉錄因子調節熱激蛋白表達量已經成為一種有效的調節方式。

有研究表明AtHSF1是組成性表達，它的 DNA 結合活性、剪接活性、轉錄活性都在正常生長溫度下被抑制，可以通過降低對 HSF （heat shock factor）功能的抑制來誘導產生熱激蛋白（Lee and Sch觟ffl, 1996）。李春光等為了提高擬南芥的耐熱能力，利用 CaMV35 作為啟動子過表達Athsf3,轉如到擬南芥，其耐熱能力明顯的升高（李春光等， 2005, 中國科學 C 輯， 35（5）：398-407）。在另外一個獨立的研究中，hsf3 基因在擬南芥中過表達，提高了擬南芥的耐熱能力（Panchuk etal., 2002）。王冬梅等認為在番茄里過表達 hsfA1 基因，過表達株系耐熱能力明顯提高，另外，對該基因沉默的植株表現出熱敏感（王冬梅等， 2003, 中國蔬菜, （2）： 58-60）。Matsukura 等（2010）研究了擬南芥中DREB2A對擬南芥的耐熱能力的影響：在植物當中過表達D,擬南芥的耐熱能力明顯提高，對照除了該基因后，擬南芥的耐熱能力下降.張宗申等（2001）認為某些低分子量的化合物例如氨基酸、聚胺類、季銨化合物、糖類和糖醇類，可以幫助植物適應大部分滲透脅迫（Gepstein et al., 2005）。

這些化合物被稱為滲透壓調節劑。甜菜堿通過提高PSII的耐氧化能力能夠起到保護光合作用機制的作用。在特定的溫度下過表達甜菜堿基因表現出明顯的生長優勢。梁崢等（1997）將菠菜中的甜菜堿脫氫酶在煙草中過表達來提高甜菜堿的表達水平，提高了煙草轉化株出幼苗生長期對高溫的耐性.高銀（2007）認為將微生物中的codA基因（編碼膽堿氧化酶蛋白）導入擬南芥，可以提高轉化植株在種子吸脹和發芽階段比野生型植株有更高的耐熱能力（Wanget al., 2010）。

只有很少的研究通過過表達脯氨酸、甘露醇、海藻糖等方法提高植物滲透耐性來間接提高植物耐熱能力（Wang et al., 2010）。

2.3改變植物細胞膜流動性來提高植物的耐熱能力

植物通過改變細胞膜油脂的構成來適應細胞外的低溫環境.早在1983年，Murata （1983）就證明提高細胞膜脂肪酸去飽和酶活性能夠提高植物對低溫的的抵耐能力.在植物最佳生長溫度下細胞膜飽和度的上升可以直接導致細胞膜的穩定提高.在轉基因煙草中沉默了葉綠體的脂肪酸去飽和酶，研究發現純和株系同野生型對比三烯脂肪酸的產量明顯下降（Murakami et al., 2000）。

耐熱試驗中轉基因煙草可以在 42℃的熱脅迫中抵抗2 h,野生型在相同條件下不能存活。Zhang 和Guy （2005）研究顯示，在煙草中過表達油菜FAD8蛋白基因比過表達其他脂肪酸去飽和酶使煙草對溫度更敏感。

2.4改變細胞內排毒作用的成分來提高植物的耐熱能力

在脅迫和正常條件細胞中都會產生活性氧簇（re-active oxygen species, ROS），然而在脅迫條件下活性氧簇的表達量迅速提高（Alscher et al., 2002）。葉綠體和線粒體的電子傳遞鏈是過氧化物的主要來源：在電子傳遞鏈產生能量的同時產生了氧自由基.生物系統通過兩種機制來減少氧自由基的產生：一種是限制它的形成；另外一種是提高對活性氧的耐性.研究表明可以利用細胞解毒物質在轉基因植物中表達，以改變植物耐熱應答.在擬南芥過表達大麥的hvapx1基因后，使得轉化株具有更高的耐熱能力（Shiet al., 2001）。Chen 等（2004）在煙草中過表達番茄的谷胱甘肽過氧化物酶，短暫的表達提高了植株耐鹽堿和耐熱的能力.Tang 等（2006）和 Jiang 等（2009）發現過表達鋅銅超氧化酶也可以提高植物耐熱能力.在熱處理條件下，因為錯折疊和聚合，細胞蛋白失去其生物學活性.研究表明那些在熱處理條件下的錯折疊和聚合細胞蛋白對細胞有毒，不正常的蛋白激活了組織中激活熱激蛋白基因表達.熱激蛋白可以提高特殊蛋白酶的合成，包括降解非正常的蛋白（Katiyar-Agarwal et al., 2001）。有研究指出熱激蛋白作為分子伴侶可以保護細胞免于熱傷害。Hsp16.9、Hsp17.1、Hsp17.3和Hsp18.1在熱激過程中可以防止蛋白聚合或者變性（Jiang et al., 2009）。在恢復階段Hsp100 通過對在熱處理條件下產生的聚合體進行再溶、修復。一些其他的熱激蛋白 Hsp40、Hsp60、Hsp70和Hsp90單獨或者協同作用穩定熱變性蛋白（Buch-ner, 1999）。

在不同的模式生物中，例如擬南芥、酵母和人類細胞，表現出一些不同的熱激蛋白都扮演著重要角色（Dragovic et al., 2006）。

綜上所述，過表達熱激蛋白，提高滲透壓調節劑積累量，特異性的改變細胞膜的流動性和提高細胞解毒酶的表達量都能提高轉基因植物的耐熱能力.研究證明，熱激蛋白以分子伴侶的形式來減少蛋白質的變性提高植物的耐熱能力.然而，其它三種途徑提高植物耐熱能力仍然存在爭議.細胞滲透調節劑可能通過創造具有強還原性的高能細胞環境來減少高溫對蛋白質的破壞.有研究表明，滲透調節劑與細胞蛋白結合來防止蛋白質變性或者聚合（Ignatova andGierasch, 2006）。細胞解毒成分也是通過減少蛋白質失活來實現耐熱能力的提高.細胞膜流動性可能在細胞形態和壓力水平上扮演著重要角色。研究發現，細胞膜的物理狀態會影響基因的表達（Vigh et al., 2007）。

改變油脂比例能夠影響細胞脅迫信號，一種是選擇總體的改變細胞物理狀態，另一種則是特異的使油脂與蛋白質結合（Vigh et al., 1998）。根據上述四種提高植物耐熱能力方法，作者構建了一個模型（圖 1）。

我們需要弄清楚如何通過防止蛋白質變性，去除變性的蛋白質以及在熱脅迫結束后的聚合蛋白質來實現減少對植物熱傷害的機制.在蛋白質代謝過程中，畸變蛋白對各種細胞性活動有重要的影響.Salvucci 等（2006）研究表明，在高溫下二磷酸核酮糖羧化酶變性是導致二磷酸核酮糖羧化酶活性損失的主要原因.隨著溫度的升高和二氧化碳濃度的升高會影響到電子傳遞和二磷酸核酮糖羧化酶的活性，對于熱激蛋白是怎樣保護蛋白的仍需進一步探索。

Chen 等（2004）對轉基因突變體進行篩選，獲得了在高溫脅迫下獲得性耐熱能力的缺陷型株系.在這些突變株系中，dgd1-2 株系不具備獲得性耐熱和基礎耐熱能力，并且其隱性基因合成二半乳糖二?；己铣擅福―GD1）。dgd1-2 株系一方面可以和野生型一樣誘導表達熱激蛋白，但是這些熱激蛋白沒有活性，這說明它的熱誘導能力還存在（Burke and Chen,2006）；另一方面，該株系也證明了脂質水平與植物耐熱能力有關.這些對以后的研究如何利用基因工程方法提高農作物耐熱能力有重要的意義.

3 結語

利用基因工程提高植物的抗逆性，成為越來越熱點的話題.目前的分子水平抗逆的研究還停留在與抗逆相關基因的表達以及調控方面，對于植物受到脅迫后，植株整體發生的網絡結構變化還不是很清楚（翁錦周和洪月云， 2006）。隨著測序技術的發展，基因組學出現了革命性的改變。大規模的生物體進行基因組測序，定可以發現大量的新的抗逆分子調節機制，對脅迫機制的研究有著重要的意義。