1989 年，美國免疫學家 Janeway 在冷泉港會議上提出模式識別理論，認為某些病原體或其產物共有在進化上高度保守的特定分子結構，這種高度保守的分子結構稱為病原相關分子模式（ Pathogen-as-sociated molecular pattern,PAMP）.PAMP 能被固有免疫細胞表面的相應受體，即模式識別受體（ Pat-tern recognition receptor,PRR） 所識別，并相互作用激活免疫功能。
在高等動物中迄今已經發現了三大家族的模式識別受體（ PRR） ,分別是 Toll 樣受體（ TLR） 、視黃酸誘導基因樣受體（ RLR） 和 Nod 樣受體（ NLR） .
目前研究最多的 PRRs 是 Toll 樣受體（ TLRs） ,他們位于細胞表面或內涵體中.NOD 樣受體（ NOD-like receptors,NLRs） 是近年來發現的胞質型模式識別受體（ PRRs）,通過識別病原相關分子模式（ PAMPs） 迅速啟動先天性免疫，并能通過信號傳導啟動適應性免疫，在機體的免疫防御中發揮重要作用.已知 NLRs 由 NOD 亞家族、NALP 亞家族和IPAF 亞家族等成員組成。NALP3 作為 NALP 亞家族成員，有研究結果表明其能識別多種微生物,并且與 TLR 受體有協同作用,在機體先天性免疫反應和疾病發生過程中具有重要作用.
本試驗采用RT-PCR 技術克隆雞NALP3 基因的部分序列，并檢測雞 NALP3 基因在其心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胸腺、法氏囊、小腸、輸卵管、卵巢、睪丸和腦12 種組織中的表達情況，為進一步深入研究雞 NALP3基因在禽類先天性免疫中的作用奠定基礎。
1 材料與方法
1. 1 試驗材料
試驗選擇 12 周齡的公、母清遠麻雞各 3 只，解剖后分別采集心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胸腺、法氏囊、小腸、輸卵管、卵巢、睪丸和腦 12 種組織，立即投入液氮中保存備用。試驗用清遠麻雞來源于國家級地方雞種基因庫（ 江蘇） .
1. 2 主要試劑和儀器
TRNzol-A+ 總 RNA 提取試劑 （ DP421 ） 、Super-RealPreMix（ SYBR Green,FP204-01 ） 、Quant cDNA第一鏈合成試劑盒 （ QuantScript RT Kit,KR103-04） 、pGM-T 克隆試劑盒（ VT302-02） 、質粒小提試劑盒（ TIAN prep Mini Plasmid Kit,DP103-02） 、DNA 產物純化回收試劑盒 （ TIAN quick Midi PurificationKit,DP204-02 ） 購自 TIANGEN 公司； DNA markerDL2000 為 TaKaRa 公司產品； 瓊脂糖和 DEPC 為Promega 公司產品。
熒光定量分析采用 Stratagene 公司的 Mx3000P型 PCR 儀，PCR 儀（ Eppendorfmastercycler） ; 凝膠成像系統（ Tanon 3500R） ; 紫外分光光度計（ GeneQuantII,Pharmacia Biotech） ; 高速冷凍離心機 （ Eppendorfcentrifuge 5417R） .
1. 3 試驗方法
1. 3. 1 雞 NALP3 基因部分 cDNA 片段的獲得 采用TRNzol 法提取 12 種組織的總 RNA; 組織總 RNA 提取按照 TRNzol-A+總 RNA 提取試劑的說明書進行，提取的 RNA 沉淀用適量的 DEPC 溶解后，進行瓊脂糖電泳檢測，分光光度計檢測 RNA 純度和含量。經檢測合格并定量的總 RNA 參照 cDNA 第一鏈合成試劑盒說明書逆轉錄成 cDNA.首先根據 GenBank 中已經公布的原雞 NALP3 基因核苷酸預測序列（ 登錄號： XM_001233261. 2） ,采用 Primer Premier 5. 0 軟件設計引物： 上游引物序列 5'-ACCGCTACACCAACCT-GAC-3'; 下游引物序列 5'-TCCCTTCCACCCACTCCAT-3',目的序列片段長度為 210 bp.PCR 反應體系總體積20 μl,退火溫度 60 ℃，72 ℃延伸 10 min,35 個循環。擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測、回收純化后與 pGM-T 載體連接構建重組質粒，轉化感受態大腸桿菌（ E. coli） TOP10,挑取轉化子于含氨芐抗性的LB 液體培養基中，37 ℃ 200 r / min 振搖培養過夜，用PCR 鑒定。鑒定正確的質粒的序列測定及引物序列合成均由上海生工生物工程技術服務有限公司完成。
1. 3. 2 雞 NALP3 基因的組織表達差異分析 采用Real time-PCR 法檢測雞 NALP3 mRNA 在各組織中的表達情況。NALP3 熒光定量 PCR 引物為： 上游引物 5'-ACCGCTACACCAACCTGAC-3'; 下游引物 5'-TCCCTTCCACCCACTCCAT-3',片段長度為 210 bp.內參 β-actin 引物為： 上游引物 5'-TGCTGTGTTC-CCATCTATCG-3'; 上游引物 5'-TTGGTGACAATAC-CGTGTTCA-3',片段長度為 150 bp.熒光定量 PCR反應體系（ 20. 0 μl） 如下： cDNA 2. 0 μl,2×SYBR re-al-time PCR premix 10. 0 μl,50 × ROX reference dye0. 4 μl,上、下游引物各 0. 8 μl,ddH2O 6. 8 μl.40個循環 （ 95 ℃，20 s; 60 ℃，15 s; 72 ℃，15 s） ,將 cD-NA 樣品進行 2 倍梯度稀釋制作標準曲線，擴增后進行熔解曲線分析。
用 Mx3000P 型 PCR 儀分析雞 NALP3 基因在不同組織中的表達情況。Real-time PCR 反應為： （ 1）95 ℃ 15 min; （ 2） 95 ℃ 20 s,60 ℃ 15 s,72 ℃ 15 s,40 個循環； （ 3） 95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s.每一個循環結束后實時測定熒光值，全部循環結束后測量熔解曲線。按照參考文獻[10]中 2-△△Ct方法分析 NALP3 基因的相對表達水平。
2 結 果
2. 1 NALP3 基因的中間段 cDNA 序列的克隆
采用 RT-PCR 的方法獲得條帶單一、明亮的目的片段，經測序為 210 bp（ 圖 1） ,陰性對照管不加cDNA 模板，未見目的片段?！緢D1】
2. 2 Real-time PCR 標準曲線、擴增曲線和熔解曲線
將 cDNA 樣品進行 2 倍梯度稀釋后，將 2 種標準品在同一試驗中運行，進行 NALP3 和 β-actin 基因的定量 PCR 反應，得到標準曲線方程分別為： Y= -3. 425 lgx+33. 34 和 Y = -3. 486 lgx+23. 95.曲線擬合度（ R2） 分別達到了 0. 998 和 1. 000,說明具有非常好的線性關系，擴增效率分別為 104. 6% 和102. 8% ,擴增效率相對偏差小于 5. 0% ,可以進行準確的定量。熔解曲線峰形單一，說明反應特異性好，符合 SYBR Green 染料的檢出要求。2 個基因的特異性擴增產物均具有相同的峰值，重復性好，且無引物二聚體和非特異性峰的存在，說明產物的特異性較好，達到了熒光定量的要求（ 圖 2） .
2. 3 雞 NALP3 基因在雞不同組織中的表達
以 β-actin 為內參照基因，采用相對定量的方法對雞 NALP3 基因在雞體內各組織中的表達水平進行檢測，結果（ 圖3） 顯示，雞 NALP3 基因在所檢測的 12種組織中均有表達，以小腸作為對照，表達量定為 1,其他各組織中的表達量分別為： 心臟 13. 30、胸腺11. 82、法氏囊 7. 13、腦 2. 25、睪丸 8. 26、肝臟 1. 16、脾臟2. 08、卵巢 2. 22、腎臟 3. 26、輸卵管 3. 27 和肺臟5. 06,在心臟中的表達量最高，小腸中的表達量最低?！緢D3】
3 討 論
NALP3 是 NLR 受體家族的重要成員，具有重要生理意義，一旦突變會引起人類很多疾病，如寒冷誘導的自發性炎癥綜合征.有關 NALP3 基因已有較多研究,取得了很多研究進展,但主要集中于人和小鼠，尚未見在禽類中的研究報道。
不同細胞、不同組織在生命活動中起到不同的作用，對某一基因在細胞水平或組織水平的表達分布特征以及在整個生命周期中表達時序性特征的研究，能夠為基因的功能分析提供參考。目前已知NALP3 主要表達于巨噬細胞和外周血白細胞,但在組織中的分布情況尚不清楚，因此本文采用反轉錄 PCR 技術克隆雞 NALP3 基因的部分 cDNA 片段，并采用熒光定量 PCR 技術檢測雞 12 種組織中NALP3 基因的相對表達水平，從轉錄水平研究NALP3 基因的組織分布情況。
曾有研究檢測了人的血液、骨髓、脈管、心臟、腦、淋巴結、胰腺、胎盤、脾臟、胸腺和氣管等 11 種組織中 NALP3 基因表達情況，結果表明，在骨髓和胸腺中高表達，在血液、腦、胰腺中表達量相對較低，在其他幾種組織中沒有檢測到 NALP3 表達.本試驗采用熒光定量 PCR 方法，檢測雞 NALP3 mRNA在雞體內各組織中的表達水平，結果表明，NALP3基因在 12 種組織中均有表達，但表達水平存在差異，在所檢測的 3 個免疫器官中，胸腺和法氏囊表達量很高，但脾臟中表達量較低，說明 NALP3 中樞免疫器官中可能發揮更重要作用。在具有性別特征的器官中，睪丸中表達量很高，而輸卵管和卵巢中表達量較低，提示 NALP3 基因的表達可能與性別有關。
另外，在所檢測的 12 種組織中，NALP3 在心臟中表達量最高，小腸中表達量最低。我們的結果與在人中的研究結果有部分一致（ 胸腺中高表達，腦中低表達） ,但我們檢測到 NALP3 在雞心臟中高表達，而在人心臟中卻未被檢測到，結果不一致，這可能與組織的來源和年齡等有關，提示 NALP3 的表達可能有時間和物種差異，這種差異還需做進一步驗證。
總之，NALP3 基因在雞體各組織中廣泛表達，表明雞 NALP3 基因可能在雞體內發揮重要的作用。
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