血小板輸注是臨床輸血的重要組成部分,已成為治療各種原因引起血小板減少癥的最有效的手段之一。研究表明,絕大多數已知的人類血小板抗原\\(human platelet antigen,HPA\\)位于糖蛋白GPⅡb/Ⅲa復合物上。近年來,隨著分子生物學的發展,人類血小板抗原系統的分子機制已經明了,傳統的血小板抗原的血清學檢測方法已經逐漸被分子生物學技術所代替,這種改變對于利用實驗室檢測來診斷同種免疫性血小板疾病具有重要的意義。此外,基因檢測HPA系統中各種抗原的等位基因,是研究那些可能含有HPA抗體患者所必須的,并可為血小板輸注無效\\(PTR\\)患者提供HPA相合的血小板。筆者利用PCR-SSP技術鑒定HPA的基因型,從而建立一套適合本地區HPA的基因鑒定方法,現報告如下。
材料與方法
1樣本來源隨機選擇2011年5～12月洛陽市中心血站無血緣關系的獻血者400例,其中男性267例,女性133例,年齡24～47歲。靜脈抽取獻血者外周血5 ml,枸櫞酸鹽抗凝。
2主要儀器與試劑PCR儀由美國ABI公司提供,PCR擴增試劑盒購自大連寶生物工程公司,血液基因組小量提取試劑盒購自北京康為世紀生物科技公司。
3DNA提取嚴格按試劑說明書操作。
4PCR反應
4.1引物合成:參考文獻[3]合成相關引物,由上海生工生物工程公司合成,用TE Buffer稀釋為5μmol/L應用液,于-20℃保存備用。
4.2PCR反應:根據各引物GC%及Tm值的差異,分別選擇以下反應體系:\\(1\\)50μl反應體系:2×GC BufferⅠ25μl,dNTP Mixture 8μl,正、反向引物\\(HPA-2、3、6、9、10、12\\)各20μmol/L,內參引物各5μmol/L,模板DNA 200 ng,TaKaRa LATaq\\(5 U/μl\\) 0.5μl,滅菌去離子水補充至50μl。擴增條件:95℃5 min;95℃30 s,58℃40 s,72℃30 s,35個循環;72℃5 min,降溫至4℃保存。\\(2\\)50μl反應體系:10×Ex Taq Buffer 5μl,dNTPMixture 4μl,正、反向引物\\(HPA-1、13、15、16\\)各20μmol/L,內參引物各5μmol,模板200 ng,TaKaRa Ex Taq\\(5 U/μl\\) 0.25μl,滅菌去離子水補充至50μl。擴增條件:95℃5 min;95℃45 s,56℃40 s,72℃30 s,35個循環;72℃5 min,降溫至4℃保存。
4.3產物分析:取PCR產物2μl,滅菌去離子水7μl,10×Loading Buffer 1μl,混勻,上樣,在1×TAE緩沖液中用100 V電壓電泳20 min,紫外燈下觀察結果并拍照保存。
結果
1洛陽地區血小板抗原等位基因分型\\(PCR-SSP\\)結果見圖1。
2洛陽地區HPA基因檢測及等位基因\\(a和b\\)分布見表1。
討論
人類血小板表面復雜的血型抗原可分為兩大類,即血小板相關抗原和血小板特異性抗原\\(HPA\\)。HPA系統是由于編碼血小板膜糖蛋白基因發生單個核苷酸替換而形成的,均由高頻基因“a”和低頻基因“b”2個等位基因組成[4]。所有血小板抗原的雙等位基因多態性的分子基礎與血小板糖蛋白\\(GP\\)變異體有關,如GPⅡb、GPⅢa、GPⅠb及GPⅠa等,而這些因氨基酸置換產生的糖蛋白變異體與血小板特異性抗原發生同種免疫的概率密切相關。因同種免疫產生的血小板抗體可導致新生兒免疫性血小板減少癥\\(NAIT\\)、輸血后紫癜\\(PTP\\)以及血小板輸注無效\\(PTR\\)等,是臨床輸血中不能忽視的問題。
本研究收集了400例無償獻血者樣本,對洛陽地區血小板抗原系統的主要抗原進行基因檢測,并計算這些抗原在隨機輸血中發生不合的概率。結果發現,所檢測的血小板抗原中全部含有高頻基因“a”,且HPA-9、10、12、13、16均為“aa”純合子。低頻基因“b”出現的頻率較低,僅在HPA-2、3、15發現了“bb”純合子。此外,“aa”、“ab”、“bb”三種基因型在絕大多數抗原中分布差異顯著,且“aa”型所占比例最大。值得注意的是,在HPA-3和15兩種抗原中,3種基因型所占比例的差異并無統計學意義。
通過計算各種抗原出現隨機輸血不合的概率\\(MP\\),我們發現“a”、“b”兩種等位基因所占比例越相近,發生輸血不合的概率就越大,而均為“aa”純合子的那些抗原,這種概率則為0。值得注意的是,在HPA-3和HPA-15中,“a”、“b”等位基因頻率幾乎相等\\(分別為0.528 8和0.471 2、0.526 3和0.473 7\\),而MP值也最大\\(分別為37.416 9%和37.430 7%\\)。所以,推測HPA-3和HPA-15是引起本地區血小板輸注不合的主要原因,同時也可能是導致因血小板特異性抗原發生同種免疫而引起相關疾病的主要原因。
本研究成果有助于為血小板輸注無效患者提供HPA相合的血小板,從而提高血小板的輸注效果,同時可以輔助診斷血小板相關疾病。遺憾的是,由于本研究中收集的樣本量有限,而建立本地區的血小板基因庫,則需要檢測HPA系統的其他抗原,如HPA-4、HPA-8等,同時應加大樣本量作進一步研究。
參考文獻
1Allen DL, Abrahamsson S,Murphy MF,et al. Humanplatelet antigen 1a epitopes are dependent on thecation-regulated conformation of integrinα\\(IIb\\)β\\(3\\)\\(GPIIb/IIIa\\)[J]. J Immunol Methods,2012,375\\(1-2\\):166-175.
2周瓊秀,李執如,陳靜嫻.PCR-SSP在人類血小板抗原1-6、15系統基因分型中的應用[J].中國輸血雜志,2009,22\\(04\\):43-44.
3Xia WJ,Ye X,Tian LW,et al.Establishment of plateletdonor registry improves the treatment of platelettransfusion refractoriness in Guangzhou region ofChina[J]. Transfus Med, 2010,20\\(4\\):269-274.
4Xu X,Liu Y,Ying Y,et al. Human platelet antigenallele frequencies and new mutations on plateletglycoprotein genes in the Chinese Han population[J].Transfus Med,2011,21\\(5\\):330-337.
5Brouk H, Halle L, Bertrand G,et al. Human plateletantigen allele frequencies in different Algerianpopulations[J]. Tissue Antigens, 2010, 75 \\(6\\): 673-678.
