載脂蛋白E\\(apo1ipoproteinE,apoE\\)是乳糜微粒\\(CM\\)、極低密度脂蛋白\\(VLDL\\)、高密度脂蛋白\\(HDL\\)的重要組分。
繼人類apoE基因于1973年首次發現后,陸續在小鼠、大鼠、豬、狗、牛、猴子等動物體內也發現了它的蹤影。而且在一些動物中,apoE基因的結構有較高的相似性,如人、豬和小鼠的apoE基因均由4個外顯子和3個內含子組成。
apoE基因編碼的apoE蛋白在穩定微管蛋白結構、細胞內信號傳導、免疫調節、糖代謝、氧化應激、脂質代謝及其他細胞過程中發揮重要作用,與人類的衰老,心血管疾病密切相關,apoE基因的多態性及其表達越來越受到研究者的關注,其中小鼠被廣泛用作該基因作用機制研究的動物模型。如apoE基因敲除小鼠的出現,增加了一個可用于評估研究人類衰老性疾病的動物模型,它有助于深化研究apoE基因的功能,為多種疾病的治療提供了藥物篩選的平臺。盡管小鼠被廣泛用作該基因作用機制研究的動物模型,但未見該基因在小鼠各種組織表達的研究報道。本研究通過對小鼠apoE基因表達譜的分析,為小鼠的apoE基因的研究及其動物模型的利用積累基礎性的資料。
1、材料與方法
1.1試驗動物:健康清潔級昆明種小鼠3只,雌性,40d齡,平均每只體重\\(28±3\\)g\\(廣西醫科大學實驗動物中心提供,批號:06002002001\\)。處死動物前禁食12h,僅供飲水。頸椎脫臼處死動物,取心、肝、脾、肺、腎、腦、脊髓、胃、小腸、胸腺、腎上腺、胰腺、膀胱、子宮、主動脈、血液、腹肌等17種組織,每樣組織標本約100mg,分別放入含有500μLRNA保存液\\(北京康為世紀生物科技公司\\)的1.5mLEP管中備用。
組織樣本采集均于處死動物后30min之內完成,所用解剖工具和EP管均用0.1%DEPC\\(北京天根生化科技公司\\)水浸泡過夜后高溫高壓消毒。
1.2方法
1.2.1總RNA抽提:總RNA提取選用上述小鼠的心、肝等17種不同組織,取80~100mg組織樣在無RNA酶的研磨器中勻漿后采用Trizol-異丙醇\\(美國Invitrogen公司\\)沉淀法提取總RNA,1%的瓊脂糖凝膠電泳驗證RNA的完整性,并于-70℃保存備用,具體操作按照Invitrogen公司提供的RNA提取試劑盒說明書進行。
1.2.2總RNA檢測及濃度測定:總RNA的完整性可通過普通瓊脂糖凝膠電泳檢測。微量核酸蛋白分析儀\\(美國QuawellTechnology.Inc\\)測量總RNA樣品濃度,每個樣本重復測量3次,取平均值。
1.2.3總RNA反轉錄:在經DEPC處理過的0.2mL離心管中加入總RNA,其中:肝RNA取3μL,脊髓、胰腺、心、肺、脾、腎、腦、胃、小腸、胸腺、腎上腺、膀胱、子宮、主動脈、血液和腹肌RNA各取5μL,分別加入1μLOligo\\(dT\\)18\\(100μmol/L\\)和1μLRandomPrimer\\(100μmol/L\\)\\(加拿大MBIFermentas公司\\),用RNase-freeddH2O將體系補足至12μL。彈指混勻后短暫離心,65℃孵育5min,迅速置于冰上。
向反應體系加入5×MuLVBuffer4μL,dNTPs\\(10mmol/μL\\)2μL,RibolockInhibitor\\(5U/μL\\)1μL,M-MuLV反轉錄酶\\(5U/μL\\)1μL,使反應終體積為20μL,混合均勻并短暫離心,于45℃溫育60min,70℃5min以滅活反轉錄酶,然后放置于冰上冷卻。
1.2.4引物設計與PCR擴增:PCR擴增的引物設計參照GenBank中公布的MusmusculusapolipoproteinE的mRNA核酸序列\\(NM_009696.3\\),PCR引物由Oligo6.0軟件設計,由上海生物工程公司合成。上游引物apoE-F:5’
-gaacaac-ccgcctcgtgacag-3’;下游引物apoE-R:5’
-tggcagtgcgctggcgac-ctt-3’,目的片段的長度為781bp。使用β-actin作為內參,上游引物β-actinF5’
-tgaccggcctgtatgctatc-3’,下游引物β-actinR5’
-tcacatgtctcgatcccagtag-3’,片段長度310bp。PCR反應條件:94℃預變性5min;94℃變性1min,61.5℃退火45s,72℃延伸1min,共35個循環,72℃延伸10min。取PCR產物5μL進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳,并在凝膠成像系統\\(美國Bio-Rad公司\\)上觀察擴增效果并照相。
2、結果
2.117種組織總RNA的檢測:小鼠17種組織總RNA1%瓊脂糖凝膠電泳顯示出2條清晰的條帶,分別為28S和18S,表明總RNA較完好。經微量核酸蛋白分析儀測定,所提取的總RNA在260nm的吸收值與280nm的吸收值比值均在1.8~2.0之間,提示無蛋白質和其他雜質污染,提取的總RNA質量符合實驗要求,可用于后續組織表達譜分析。
2.2小鼠apoE基因組織表達譜分析:將小鼠各個組織反轉錄獲得的cDNA作為模板用于組織表達譜分析。經PCR擴增后,取5μL產物在1.5%的瓊脂糖凝膠中電泳。用Im-ageJ2X圖像分析軟件對3次電泳的圖像進行處理和分析,并計算各組織的apoE基因相對表達量。結果顯示:在40d齡小鼠的17種組織中,apoE都有不同程度的表達,各組織按相對表達量的大小依次為肝\\(62.2%\\)、脊髓\\(61.8%\\)、腦\\(58.0%\\)、肺\\(57.1%\\)、腎\\(55.4%\\)、心\\(55.3%\\)、脾\\(48.5%\\)、胸腺\\(35.8%\\)、小腸\\(29.6%\\)、胃\\(22.7%\\)、膀胱\\(18.5%\\)、血液\\(15.1%\\)、腎上腺\\(13.3%\\)、子宮\\(10.0%\\)、胰腺\\(8.7%\\)和主動脈\\(6.0%\\),但在腹肌\\(0.0%\\)無表達\\(圖1\\)。
3、討論
根據GenBank公布的資料,人\\(GeneID:348\\)、豬\\(GeneID:397576\\)和小鼠\\(GeneID:11816\\)3個物種的apoE基因結構都比較相似,均由4個外顯子和3個內含子組成,第1,2號外顯子都很短且對應的外顯子長度都接近,約70bp。盡管這些物種的apoE基因的細微結構存在差異,但毫無疑問它們的功能是一樣的,是參與膽固醇和脂類代謝的重要基因。小鼠的apoE基因位于7號染色體,其編碼的apoE的氨基酸序列與人的有30%的差異,這些差異多存在于N端和C端,2個物種的apoE受體結合域\\(136~160bp\\)高度保守,25個殘基中有21個是相同的,但從功能上看,這二者功能的相似度有多大還不清楚。國內外的許多研究都借助apoE基因敲除小鼠作為疾病模型,模擬糖尿病人由于血脂異常導致的神經性病變。用高脂飼料喂養apoE基因敲除小鼠時,小鼠血中膽固醇含量增高而且動脈出現粥樣硬化等癥狀。另外,其巨噬細胞、T細胞和平滑肌細胞的生理反應和人類心血管疾病中的反應極為相似?？梢?研究小鼠的apoE基因表達譜可以與人或其他物種的互相比較,從而為apoE基因作用機制積累基礎性的資料。
為準確檢測apoE基因表達,本研究在小鼠apoE基因的中段設計引物,目的片段長度為781bp,涵蓋了apoE基因第1,2,3號外顯子的全部和第4號外顯子的一部分。結果顯示apoE在肝表達量最高,脊髓和腦亦是高表達的組織。小鼠apoE基因在肝和中樞神經組織的高表達,提示這些組織是小鼠apoE的主要代謝場所,該基因在維護中樞神經系統的功能方面起著重要的作用,這與人和豬的apoE基因表達基本相同。
人體很多組織均有apoE合成,除了肝和腦外,腎也是apoE基因高表達區,豬的腎表達顯然沒有肝和腦的高。而小鼠腎的表達略高于大腦。小鼠和人的心、脾、胃均有表達,但豬的則未見有表達。根據現有的資料來看,小鼠和人的apoE基因表達一致的組織種類多于小鼠和豬。小鼠和人的apoE基因除了4個外顯子有很高的同源性外,在基因的5’端約200bp的側翼序列同樣有較高的同源性。造成人、豬和小鼠的apoE表達方面的差異的原因除了遺傳構成的原因外,可能涉及到其他調控系統。
人的巨噬細胞也是apoE合成的主要細胞之一,它可以通過合成分泌apoE,參與神經的再生與修復。雖然本研究沒有專門分離小鼠的巨噬細胞,但小鼠的胸腺、主動脈和血液中存在著巨噬細胞,所以尚不能斷定apoE基因的mRNA是由這些組織的實質細胞還是由其中所含的巨噬細胞產生,或者二者皆參與了apoE基因的表達。
薛越強等在構建人apoE基因的轉基因小鼠時,發現人apoE基因在Fl代轉基因鼠的多種組織中均有表達,其中最強的表達出現在腎,在腦和心中有中等程度的表達,而肝的表達較少,脾中則近乎沒有表達。這與人的apoE基因在肝表達最強、腦次之以及小鼠的肝表達最強、脊髓次之明顯不同,這些結果表明,apoE基因在轉基因小鼠體內的表達有組織特異性,不同的遺傳背景會導致apoE基因的表達譜的改變,在利用小鼠作為研究人類疾病模型時,應加以考慮。
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