I型葡萄糖載體\\(mGLUT1\\)在各種組織中分布比較廣范,主要參與葡萄糖的主動吸收過程和其他能量物質的代謝過程.mGLUT1表達水平在癌癥、缺氧及炎癥等多種病理狀態下有較明顯的增高.HNF-1α在肝細胞和胰腺β細胞中高表達,參與體內葡萄糖及脂肪代謝的調節過程.HNF-1α是細胞中肝細胞核因子\\(HNF\\)的一個亞型,是一種轉錄調節因子,在轉錄水平參與包括葡萄糖激酶在內的多種蛋白質的表達過程.
本實驗為了探討HNF-1α與mGLUT1的表達調節過程的相互關系,應用DNA重組技術組建了HNF-1α的蛋白質表達質粒,將重組HNF-1α表達質粒按照時間和劑量梯度瞬間轉染CV-1細胞,應用RNA印跡法檢測mGLUT。1mR-NA的表達和穩定性實驗結果表明,mGLUT1、mRNA的表達和穩定性在HNF-1α存在的條件下有明顯的增強.
1、材料和方法
1.1材料
CV-1細胞株\\(ATCC\\);Dulbecco’smodifiedEagle’s培養液\\(DMEM,Life Technologies,Gaithersburg,MD,美國\\);DNA提取層析柱\\(Qiagen,Hilden,Germany\\);pCRⅡ-TOPO載體\\(Life Technolo-gies,Gaithersburg,MD,美國\\);OPTI-MENⅠ\\(Life Technologies,Gaithersburg,MD,美國\\);Lipo-fectAMINEPLUS試劑\\(Life Technologies,Gaithers-burg,MD,美國\\);裂解緩沖液\\(Promega,Madison,WI,美國\\);TRIzol試劑\\(LifeTechnologies,Gaith-ersburg,MD,美國\\).
1.2方法
1.2.1重組體的構建
利用PCR擴增將HNF-1αcDNA擴增,擴增片段插入到pCRⅡ-TOPO載體.用內切酶KpnⅠ/EcoRⅠ內切cDNA后,將酶切片段亞克隆到KpnⅠ/EcoRⅠ酶切的pSV-sport載體上,組建重組體pSV-sportHNF-1α.應用Sanger法確定重組體的DNA堿基序列.
1.2.2重組體瞬間轉染
將重組DNA轉染到大腸桿菌感受態細胞后,在TB培養液中培養8h,利用層析柱提取純化.按照細胞密度1×106個細胞/孔培養CV-1細胞,經過20h培養吸附后,將重組DNA利用Lipofect AMINEPLUS試劑轉染CV-1細胞.轉染細胞繼續培養18h,利用TRIzol試劑提取RNA.
1.2.3Northern、blot
用上述方法將HNF-1α轉染CV-1細胞后,轉染細胞繼續培養18h,利用TRIzol試劑提取總RNA.20μg總RNA在含有5%\\(質量分數\\)甲醛的1%\\(質量分數\\)變性瓊脂糖中進行電泳,然后將RNA轉移到尼龍膜上并UV交聯.尼龍膜在雜交緩沖液中進行預雜交,然后在65℃下與mGLUT1探針進行雜交2h.雜交完畢后尼龍膜在37℃下用2xSSC,0.1%\\(質量分數\\)SDS\\(高鹽洗液\\)進行15min2次沖洗,然后用0.2xSSc,0.1%\\(質量分數\\)SDS\\(低鹽洗液\\)沖洗.沖洗后將尼龍膜放置在膠片下,-70℃條件下過夜.將18S和28SRNA作為對照.
1.2.4統計學分析
采用SPSS17.0統計軟件進行數據分析.計量資料的數據以均數±標準偏差\\(x珚±SD\\)表示,進行單因素方差分析,以P<0.05為差異有統計學意義.
2、結果
2.1在CV-1細胞中HNF-1α可增強mGLUT1mRNA表達
為確定在體內條件下HNF-1α是否可以調節mGLUT1 mRNA的表達,進行了劑量梯度組Northernblot,結果表明在體內條件下CV-1細胞中HNF-1α可增強mGLUT1mRNA的表達\\(圖1\\).
2.2在CV-1細胞中HNF-1α可增強mGLUT1 mRNA表達的穩定性
為確定在體內條件下HNF-1α是否可調節mGLUT1mRNA表達的穩定性,進行了時間梯度組Northernblot,結果表明在體內條件下CV-1細胞中HNF-1α可增強mGLUT1mRNA表達的穩定性\\(圖2\\).
3、討論
肝細胞核因子在肝細胞和胰腺β細胞中高表達,是這些組織中某些靶基因表達的重要的轉錄調節因子,其中HNF-1主要在肝細胞中表達.HNF-1α作為HNF-1的一個亞型可與GGTTAAT-NATTA\\(A/C\\)Ca相關聯的序列結合,對某些基因的表達具有重要的調控作用.
研究結果表明,HNF-1的表達可參與胰島素介導的糖、脂代謝相關基因的表達調控.mGLUT1參與體內葡萄糖水平的調控,而GLUT1基因的mRNA穩定性較差,這種結構的不穩定性是由GLUT1mRNA的3′末端的多聚腺苷尾\\(3′-UTR\\)結構決定的,這種末端結構可以和多種蛋白質結合后影響mGLUT1mRNA的穩定性,即促進其mRNA的降解,因此這種結構降低mGLUT1的蛋白質表達.據報道,經胰島素處理后的3T3-L1脂肪細胞和L6肌肉細胞可以增加mGLUT1的表達水平.
另有研究結果表明,在動物糖尿病模型和糖尿病患者的組織樣品中mGLUT1的蛋白質表達不明顯,但是經過處理胰島素后mGLUT1mRNA的表達水平有明顯的提高.這些實驗結果表明,經過胰島素處理后的mGLUT1mRNA表達水平的增強有可能與mGLUT1基因和胰島素或其傳導通路中的某些蛋白因子的相互作用有關.綜上分析,可以推測HNF-1α蛋白質可能間接或直接影響mGLUT1的蛋白質表達調節過程.
本實驗結果表明,mGLUT1mRNA表達水平在HNF-1α蛋白質存在的條件下可增高,且表達穩定性增強.
總之,HNF-1α可能通過促進mGLUT1的表達參與胰島素介導的對mGLUT1的表達調節,在轉錄調節水平參與體內葡萄糖代謝的調節.
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