副溶血弧菌\\( Vibrio parahaemolyticus,簡稱 VP菌\\) 是一種革蘭氏陰性弧菌,主要分布于海水、海河交界處及海產品中。人們食用被其污染的食物后,很可能會引起以發熱、腹瀉、嘔吐等為主要癥狀的急性胃腸炎,嚴重者可引起脫水、休克,甚至死亡。VP 菌可以游離于海水環境,也可以在固相表面形成生物膜,生物膜是其適應不利環境而采取的主要生存策略。生物膜形成受密度感應\\( Quorum sensing,QS\\) 系統和 c-di-GMP 信號通路的調節。QS 是一種密度依賴性的細胞間信號傳遞機制。

在這一機制中,細菌通過合成、分泌及感應自誘導因子,并通過一系列的級聯信號傳導,最終開關 QS 系統核心調控子的表達,核心調控子進而再調節細菌的運動、生物膜形成和毒力因子表達等。VP 菌能分泌 3 種自誘導因子 HAI-l、AI-2 及 CA-l,它們與受體蛋白結合,在 Qrr sRNAs 的參與下,調節核心調控子 OpaR 和 AphA 的表達。在高密度時,OpaR起核心調節作用,它能抑制毒力因子\\( T3SS\\) 的表達和在固相表面的爬動能力\\( laf\\),而促進莢膜多糖\\( CPS\\) 的合成。在固相表面的爬動是生物膜形成的起始步驟,而 CPS 是生物膜基質的主要成份之一; 在低密度時,AphA 起核心調節作用,表型結果顯示它能促進毒力因子的表達和生物膜形成,但是其分子機制還未被闡明。

c-di-GMP 是一個普遍存在的第二信使分子,能促進細菌生物膜的形成。c-di-GMP 的分子代謝受GGDEF 和 EAL 結構域的調節。GGDEF 具有鳥苷酸環化酶活性,能以 GTP 為底物催化合成 c-di-GMP;而 EAL 具有磷酸二酯酶活性,能使 c-di-GMP 降解成 GMP。VP 菌有 50 多個蛋白參與 c-di-GMP 的分子代謝\\( 含有 GGDEF、EAL 或二者兼有\\) ,包括ScrC和 ScrG,二者均兼具 GGDEF 和 EAL 結構域。ScrC 由操縱子 scrABC 編碼,ScrA 產生 S 信號,ScrB 感應這種信號并與 ScrC 相互作用,使得 ScrC表現出 EAL 的磷酸二酯酶活性,并降解 c-di-GMP,抑制 CPS 的合成,而激活 laf 的表達。ScrG也主要表現為磷酸二酯酶活性,并發揮與 ScrABC相似的功能。Scr 通路是 VP 菌生物膜形成的另一信號傳導途徑,它是否與 QS 系統相關聯,目前還未見報道。

在本研究中,我們首先利用表型實驗\\( 褶皺和結晶紫染色\\) 驗證了 AphA 能促進 VP 菌生物膜形成,進而利用 HPLC-MS/MS 的方法測定了野生株和aphA 突變株中 c-di-GMP 的含量,最后利用實時定量 RT-PCR、LacZ 和 EMSA 等實驗技術,證明了AphA 能通過間接抑制 scrABC 和 scrG 的轉錄表達而促進 c-di-GMP 的合成,進而增強 VP 菌生物膜形成。

1、 材料和方法

1. 1 材料

1. 1. 1 菌株和質粒: VP 菌 RIMD2210633 株\\( 野生型,WT\\) 及其 aphA 突變株\\( ΔaphA\\) 、重組質粒 scrA: :pHRP309 和 scrG: : pHRP309 \\( pHRP309 質粒無啟動子區的 β-半乳糖苷酶基因上游分別克隆入 scrA 和scrG 的啟動子區序列,慶大霉素抗性\\) 均由本實驗室保存。

1. 1. 2 主要試劑: TRIzol Reagent 為 Invitrogen 產品; Taq DNA 連接酶、dNTPs 為 Fermentas 產品; PCR產物純化試劑盒為 QIAGEN 產品; LightCycler\ue4d0480SYBR Green Master 為 Roche 產 品; Micro BCAProtein Assay Kit 為 Thermo 產品; DNA-freeTMKit 為Amibion 產品; M 肉湯\\( Difco Marine,DM\\) 和 HI 肉湯\\( 2. 5% Bacto heart infusion\\) 購自 BD Bioscience。

1. 2 細菌培養

VP 菌培養方法分為預培養和正式培養。預培養: 取 20 μL 甘油菌種接種于 15mL 的 HI 肉湯培養基中\\( 50 mL 的三角燒瓶,下同\\) ,37℃下 200 r/min培養至平臺期\\( 12 -14 h\\) ,而后按 1∶ 50 稀釋接種至15 mL 新鮮的 HI 肉湯中,37℃ 下 200 r / min 培養至OD620大約為 1. 4。正式培養: 將預培養物按 1∶ 1000稀釋接種至 15 mL 新 鮮 的 HI 肉 湯 中,37℃ 下200 r / min培養至 OD620大約為 0. 15,收集菌體,備用。

1. 3 菌落表面褶皺

將 1. 2 中預培養物按 1∶ 50 稀釋接種至 3mL 的M 肉湯中\\( 試管\\) ,30℃ 靜止培養 4 d 后,取 1. 5 μL滴加于 HI 平板\\( 2. 5% Bacto heart infusion + 1. 5%瓊脂\\) 的表面,每株菌至少 3 個菌落的重復,37℃下靜置培養,48 h 后拍正面照。

1. 4 結晶紫染色

將 1. 2 中預培養物按 1∶ 50 稀釋接種至 2 mL 的M 肉湯中\\( 試管培養,3 個重復\\) ,置 30℃ 下 100 rpm培養 48 h。小心的倒出液體培養物,將附著于試管壁的菌膜用去離子水洗滌3 次,干燥后加入3 mL 的0. 1% 結晶紫溶液,常溫染色 30 min,再用去離子水洗滌 3 次。晾干試管,并拍照,根據結晶紫染色的強弱即可判定生物膜的形成量。

1. 5 c-di-GMP 測定

取10 mL 的1. 2 中正式培養物,收集菌體,用細菌裂解液\\( 甲醇∶ 乙腈∶ 水 = 40∶ 40∶ 20\\) 提取 c-di-GMP。利用色譜串聯質譜 \\( HPLC-MS / MS \\) 的方法,分別檢測每 mL 的細菌培養物中 c-di-GMP 的pmoL 量。同時,利用 Micro BCA Protein Assay Kit,按說明書提供的方法檢測每 mL 細菌培養物中 mg總蛋白量。細菌培養物中 c-di-GMP 濃度用 pmol/mg 蛋白表示。

1. 6 RNA 提取與實時定量 PCR\\( qRT-PCR\\)

細菌按 1. 2 的方法培養后,收集菌體,利用TRIzol Reagent 提取總 RNA。利用 Amibion 公司的 DNA-freeTMKit 去除總 RNA 中可能污染的 DNA,而后利用 N6 隨機引物將其逆轉錄為 cDNA。用Roche 的 LightCycler system 作 qRT-PCR 分析。以16S rRNA 的表達量為內參繪制標準曲線,用于基因表達水平的相對定量。

1. 7 LacZ 報告基因融合試驗

PCR 擴增 scrA 和 scrG 的啟動子區\\( 引物序列見表 1\\) ,并分別克隆入 pHRP309 質粒的 β-半乳糖苷酶基因\\( 無啟動子區\\) 的上游,得重組質粒。將重組質粒分別轉入 WT 和 ΔaphA 中。細菌按 1. 2 的方法培養后,收集菌體,分別檢測并比較 WT 和 ΔaphA 菌株中的 β-半乳糖苷酶活性的差異,從而判定 AphA對靶基因的調控關系,一般以 t 檢驗的 P < 0. 01 為判定標準。

1. 8 凝膠阻滯實驗\\( EMSA\\)

PCR 擴增 scrA 和 scrG 的啟動子區 \\( 引物見表1\\) ,并純化回收,用 T4 多聚核苷激酶\\( T4 PNK\\) 對DNA 片段 5' 末端進行標記。利用 Ni-NTA 柱法純化 His-AphA 蛋白。將不同濃度的 His-AphA 蛋白與標記的 DNA 探針在 10 μL 結合反應體系中,室溫共同孵育 20 min 后,將樣品加入 4% 非變性聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳,- 60℃放射自顯影后分析結果。

2、 結果和分析

2. 1 AphA 蛋白影響 VP 菌生物膜表型

為了研究 aphA 缺失后對 VP 菌生物膜形成能力的影響,我們對 WT 和 ΔaphA 菌株做了表型分析。圖 1-A 為菌落褶皺實驗結果,可以看出:ΔaphA 的菌落形態要比 WT 光滑的多,當把 aphA回補到 ΔaphA 菌株后\\( C-aphA\\) ,C-aphA 菌落形態又重新變得褶皺,這表明 AphA 能促進胞外多糖\\( EPS\\) 的合成; 圖 1-B 為結晶紫染色實驗結果,可以看出: ΔaphA 在試管壁的生物膜形成量明顯低于 WT 的,這表明 aphA 缺失后 VP 菌在氣液表面的生物膜形成能力降低?？傊?AphA 能促進 VP菌生物膜的形成。

2. 2 AphA 促進 c-di-GMP 的合成

上文表明 AphA 能促進 VP 菌生物膜形成,而 c-di-GMP 是促進生物膜形成的第二信使。為了驗證 AphA 是否能調節 c-di-GMP 的合成,我們利用HPL-MC / MS 的方法測定了 WT 和 ΔaphA 中 c-di-GMP 含量,其結果如圖 2 所示,可以看出: ΔaphA 中的 c-di-GMP 含量明顯低于 WT 中的,且二者具有顯著性差異\\( P <0. 01\\) ,這表明 AphA 能促進 VP 菌 c-di-GMP 的合成。

2. 3 AphA 抑制 scrABC 和 scrG 的轉錄

AphA 對 scrABC 和 scrG 調控的 qRT-PCR 結果如圖 3-A\\) 所示: scrA 和 scrG 在 ΔaphA 中的相對表達量要明顯高于 WT 中的,且二者具有顯著性差異\\( P <0. 01\\) ,這說明 AphA 抑制 scrABC 和 scrG 的轉錄。進一步利用 LacZ 報告基因融合實驗研究 AphA對 scrABC 和 scrG 的調控關系,其結果如圖 3-B\\) 所示: 克隆有 scrA 或 scrG 啟動子區的 β-半乳糖苷酶基因在 ΔaphA 中的轉錄活性\\( miller units\\) 明顯高于WT 中的,且二者具有顯著性差異\\( P < 0. 01\\) ,這進一步說明 AphA 能抑制 scrABC 和 scrG 的轉錄表達。

2. 4 His-AphA 不能結合到 scrABC 和 scrG 的啟動子區

利用 EMSA 實驗驗證 His-AphA 是否能直接作用于 scrABC 和 scrG 的啟動子區,結果如圖 4 所示:當 His-AphA 蛋白量達到 60. 0 pmol 時,仍未出現阻滯條帶,這已比前期研究中出現阻滯帶時所用的蛋白量高出數倍,這表明 AphA 不能結合到 scrABC和 scrG 的啟動子區。

3、 討論

AphA 是弧菌屬 QS 系統在低密度下的核心調控子,參與調解弧菌毒力和生物膜形成。在霍亂弧菌中,AphA 與 AphB 相互作用并激活 tcpPH 的轉錄表達。TcpP/TcpH 在 ToxR/ToxS 的協助下,激活毒力調控子 ToxT 的表達,ToxT 再激活 tcp\\( 編碼菌毛\\)和 ctx\\( 編碼霍亂毒素\\) 的轉錄,而使細菌表現出強毒性。AphA 還能激活 vpsT 的表達,VpsT 再激活胞外多糖基因 vps 的表達,而利于生物膜形成。VP菌 AphA 與霍亂弧菌的 AphA 高度同源,其功能也具有高度的相似性,但是其分子作用機制還未見報道。

scrABC 操縱子編碼 3 種蛋白: ScrA 位于胞漿中,能產生一種稱為 S 信號的信號分子,并分泌到胞外; ScrB 是位于周質的小分子結合蛋白; ScrC是一種膜結合蛋白,其 N-末端具有兩個跨膜結構域,而 C-末端具有 GGDEF 和 EAL 結構域。ScrB 受ScrA 產生的 S 信號刺激,能與 ScrC 的 N-末端相互作用,促使 ScrC 表現出 EAL 結構域的磷酸二酯酶活性,降解 c-di-GMP,抑制 cps 而激活 laf 的表達,使細菌趨于游離; 當細胞中只存在 ScrC 時,GGDEF 結構域的活性占主導地位,并能促進 c-di-GMP 和 cps合成,抑制 laf 的表達,細菌趨于形成生物膜。由于scrC 和 scrAB 位于同一操縱子,ScrA、ScrB 和 ScrC 總是同時存在,因此在生理條件下 ScrC 主要表現出EAL 結構域的活性,參與降解 c-di-GMP 和抑制生物膜形成。ScrG 是繼 ScrC 之后,在 VP 菌中發現的第2 個同時具有 GGDEF 和 EAL 結構域的蛋白。與ScrC 一樣,ScrG 也主要表現出 EAL 結構域活性,過表達 ScrG 能抑制 c-di-GMP 合成和 ΔscrABC 的表型特征。但是當 ScrG 的 EAL 結構域突變后,GGDEF結構域也具有酶活性,但是其影響 c-di-GMP 代謝機制還不清楚。

本文中,我們利用 HPLC-MS/MS、褶皺和結晶紫染色實驗證明了 AphA 能促進 VP 菌 c-di-GMP 的合成及生物膜形成,隨后的實時定量 RT-PCR 和 LacZ報告基因融合實驗結果表明 AphA 是通過抑制 scrG和 scrABC 的轉錄表達來促進 c-di-GMP 的合成,進而促進生物膜形成,這表明 Scr 通路調解 VP 菌生物膜形成并不是孤立于 QS 系統之外的。但是體外的EMSA 實驗結果顯示 AphA 與 scrABC 或 scrG 的啟動子區并無直接的相互作用,這表明 QS 系統與 Scr 通路可能還具有其他的聯系方式。在低密度生長時,AphA 能抑制 opaR 的轉錄表達,OpaR 是 QS 系統在高密度下的核心調控子,其識別基序為一個反向互補重復序列“TATTGATAAATTTATCAATA”,而在 scrABC 和 scrG 的啟動子區分別有一段堿基序列“TATAGATAAAACTATTATTA”和“TAATGAGTAT-TCAGTCAATTA”與基序非常相似,這表明 OpaR 極可能對 scrABC 和 scrG 具有直接的調節作用。AphA可能是通過抑制 OpaR 或者其他未知調控子的表達來間接抑制 scrABC 和 scrG 的轉錄表達,進而促進VP 菌生物膜形成的,在后續的研究中我們將驗證這一推測。