鹽生杜氏藻（Dunaliella salina，以下簡稱鹽藻）的細胞結構簡單，具有很強的抗鹽能力，可以生長在 5.0 mol/L NaCl 培養液中，而且其培養條件也很簡單。因此，鹽藻是研究植物耐鹽分子機制的重要模式生物。研究表明當鹽藻在高鹽環境脅迫下，體內的蛋白質合成和降解以及能量代謝等多種代謝途徑會發生很大程度的改變，其中耐鹽作用主要是依靠鹽藻中 Na+/H+泵和大量合成兼容性溶質甘油，但應答鹽脅迫的調控過程還少有報道。從信號傳導方面開展對鹽藻抗鹽生理調節過程的研究，有助于全面了解鹽藻耐鹽機制。
小 G 蛋白（Small GTP-binding proteins）分子量一般在 20-30 kD 之間，以單體形式普遍存在于真核生物中，通過激活態（結合 GTP）與非激活態（結合 GDP）的轉變來行使分子開關作用，參與重要的細胞生理活動，包括信號傳導、細胞增殖、囊泡轉運、細胞骨架重組等。Rab 蛋白是小 G 蛋白家族（Ras、Rho、Rab、Arf/Sar 和 Ran 5 個亞家族）中最大的亞家族，近年來在酵母、果蠅、擬南芥、煙草、水稻等真核生物中發現的 Rab 蛋白遍布于胞內的各個膜區室，在胞吞和胞吐作用中，不同的Rab 蛋白定位于特定的細胞器膜上，參與膜泡的形成、定向轉運、錨定鏈接等過程?，F已發現許多與植物的抗逆性有關的 Rab 蛋白，其表達量會受到鹽脅迫、低溫、干旱等逆境條件的影響。因此，深入了解 Rab 蛋白功能及進一步研究植物抗逆性相關蛋白的相互作用網絡具有重要科學意義。
本實驗室已從鹽藻細胞中成功克隆出新的 Rab蛋白基因DsRab（GenBank Accession No.JN989548），并用實時熒光定量 PCR 方法研究了DsRab基因在鹽脅迫下的表達情況，證明DsRab是一個鹽誘導上調基因。本試驗構建重組表達載體 pGS-21a-DsRab，通過優化誘導表達條件使 DsRab 蛋白在上清中的表達量增加，利用 GST-SefinoseTMKit 純化，獲得純度較高的可溶性融合蛋白，為制備抗體以及進一步在蛋白質水平上研究該蛋白在鹽藻耐鹽性機制中的作用奠定基礎。
1、材料與方法
1.1 材料
1.1.1 菌種和質粒 大腸桿菌（E.coli）菌株 DH5α、E.coliBL21（DE3）、 質粒 pGS-21a 由本室保存；pMD18-T Simple Vector 購自 TaKaRa 公司。
1.1.2 試劑 限制性內切酶、Taq酶、IPTG、X-gal、T4 連接酶購自 TaKaRa，硝酸纖維素膜、Anti-GSTAntibody、HRP-IgG、沉淀型單組分 TMB 底物溶液購自 TIANGEN，GST-SefinoseTMKit（BSP032-7），Pr-estained Protein Molecular Weight Marker 購自生工生物工程（上海）有限公司，凝膠回收試劑盒購自愛思進生物技術有限公司，其他試劑均為國產分析純。
1.2 方法
1.2.1 原核表達載體的構建 根據DsRab基因 cDNA全長序列（GenBank Accession No.JN989548）設計引物并加入酶切位點，上游引物（含EcoR I 酶切位點）P1 ：5'-CGGAATTCATGAACCCAGAGTACGACTACC-3'，下游引物（含 SalI 酶切位點）P2 ：5'-GTCGA-CCTAGCAGCAGGTGGAGCGG-3'。以總 RNA 反轉錄的 cDNA 為模板，P1，P2 為引物進行 PCR 擴增。擴增條件 ：94℃預變性 5 min ；94℃變性 30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸 1 min，35 個 循環 ；72℃延伸9 min。擴增產物經 1.0% 瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定，回收目的片段，連接到 pMD18-T simple 載體上（T-A克?。?，構建重組質粒 pMD18-DsRab，轉化 E.coliDH5α 感受態，在 Amp 抗性平板上篩選陽性單克隆。用EcoR I、SalI 雙酶切目的片段和 pGS-21a 質粒，用 T4 連接酶連接，構建表達載體 pGS-21a-DsRab，轉化E.coliDH5α 感受態，篩選陽性單克隆，交由大連寶生物公司測序，以驗證讀碼框的正確性。
1.2.2 融合蛋白的原核表達 將測序鑒定正確的表達質粒 pGS-21a-DsRab 轉化 E.coliBL21（DE3），挑取陽性單克隆，接種于 5 mL 含氨芐青霉素（50mg/L）的 LB 液體培養基中，37℃過夜培養。次日，按 1% 的比例接種到 5 mL 新的 LB 液體培養基（氨芐青霉素 50 mg/L）中，37℃振蕩培養到菌液OD600=0.6-0.8 時，試驗組加入終濃度為 1 mmol/L 的IPTG，對照組不加 IPTG，37℃誘導 6 h。離心收集菌體，用 0.01 mol/L PBS 緩沖液懸浮，冰上超聲波破碎，4℃、12 000 r/min 離心 10 min，分離上清與沉淀，加上樣緩沖液，對上清和沉淀進行 SDS-PAGE 檢測。
1.2.3 融合蛋白表達條件的優化 按 1.2.2 相同方式過夜培養的菌液，1% 的比例轉接到新的 LB 液體培養基（氨芐青霉素 50 mg/L）中，37℃振蕩培養到菌液 OD600=0.6-0.8 時，進行分組培養 ：IPTG 終濃度梯度為 0.1、0.2、0.4、0.8 和 1.0 mmol/L ；誘導溫度梯度為 25、28、30、35 和 37℃ ；培養 6 h。離心收集細菌，0.01 mol/L PBS 緩沖液懸浮，冰上超聲波破碎，離心取上清，用 SDS-PAGE 檢測。
1.2.4 重組蛋白的純化 優化表達條件下，將過夜培養的菌液按 1% 的比例接種于 100 mL 的 LB 液體培養基（含氨芐青霉素 50 mg/L）中，37℃振蕩培養至菌液 OD600=0.6-0.8，加入終濃度為 0.1 mmol/LIPTG 誘導表達，28℃振蕩培養 6 h。4℃、8 000 r/min離心 3 min，收集細菌，用 20 mL 0.01 mol/L PBS 緩沖液懸浮，冰上超聲波破碎，4℃、12 000 r/min 離心 20 min，取上清并用 0.45 μm 濾膜抽濾。用 GST-SefinoseTMKit 純化，SDS-PAGE 電泳檢測。
1.2.5 Western blotting 檢測 純化后的融合蛋白進行 SDS-PAGE 電泳，電轉移至 NC 膜（200 mA，2h），用 5% 牛血清白蛋白 4℃封閉過夜，加入一抗Anti-GST Antibody（1∶2 000），37℃孵育 1 h，0.01mmol/L PBST 洗滌 3 次，每次 5 min，然后加入二抗 HRP-IgG（1∶200），37℃ 孵 育 1 h，0.01 mmol/LPBST 洗滌 3 次，每次 5 min，然后加入沉淀型單組分 TMB 底物溶液顯色。
2、結果
2.1 原核表達載體的構建
經 PCR 擴增獲得一條 600 bp 左右的條帶（圖1-A），與預期片段大小一致。EcoR I、SalI 雙酶切重組質粒 pGS-21a-DsRab，結果（圖 1-B）表明目的片段已與 pGS-21a 質粒正確連接，重組質?？梢杂糜跍y序。測序結果表明擴增片段與DsRab基因開放閱讀框完全一致，讀碼框正確，原核表達載體 pGS-21a-DsRab 構建成功。
2.2 融合蛋白的原核表達
對照組表達菌（含有空載體 pGS-21a）誘導后，在 35 kD 左右有一條表達增強的標簽蛋白條帶，含有重組質粒的表達菌誘導后在 57 kD 左右有一條明顯表達增強的條帶，此條帶在對照組沒有出現，與預期結果相符（融合蛋白包括預計分子量為 22 kD的 DsRab 蛋白和 35 kD 的標簽蛋白）（圖 2-A）。結果還顯示，上清和沉淀均可見清晰的目的蛋白條帶，表明目的蛋白為部分可溶性表達。
2.3 融合蛋白表達條件的優化
電泳結果顯示，誘導劑 IPTG 的濃度在 0.1-1.0mmol/L 范圍內，融合蛋白的表達量沒有太大變化（圖2-B）。在 25、28、30、35 和 37℃ 5 個誘導溫度下，融合蛋白的表達量比較，在 28℃誘導時，融合蛋白的表達量最大（圖 2-C）。在最優條件下，融合蛋白的可溶性表達量顯著增加（圖 2-D）。
2.4 重組蛋白的純化及鑒定純化產物經 SDS-PAGE 檢測，在 57 kD 左右有單一蛋白條帶，表明融合蛋白被有效純化（圖 3-A）。Western blotting 檢測（圖 3-B）顯示，融合蛋白能與抗 GST 單克隆抗體特異性結合，具有良好的免疫學活性，表明融合蛋白在E.coliBL21（DE3）中成功表達。
3、討論
高鹽環境下，植物對鹽脅迫的應答是非常復雜的過程，涉及一系列與抗逆性相關的信號傳導過程。研究表明 Rab 蛋白作為一種分子開關蛋白，分布于胞內所有的亞細胞結構，不同的 Rab 蛋白與相應的上游調控因子和下游效應因子相互作用，參與了胞內幾乎所有的膜運輸過程。近來大量研究報道證實有些 Rab 蛋白與植物的高鹽適應性有關。
Mazel 等將擬南芥AtRab7在轉基因植物中表達，加速了轉基因植物根、葉和原生質體中的胞吞作用，對鹽和滲透脅迫的耐受性提高。O’Mahony 等在牧草（Sporobolus stapfianus）中發現的 sRab2 可能涉及由植物 ABA 參與的耐旱信號的傳導。水稻在冷凍、干旱及生長激素 ABA 存在的條件下，OsRab7基因的 mRNA 含量呈現不同的趨勢；高鹽脅迫下，普通冰草Rab5B、煙草PgRab7、花生AhRab7基因的表達量都有增加。
在高度耐鹽的模式生物鹽藻中，有關 DsRab 蛋白的研究鮮有報道。本實驗室已經克隆得到鹽藻新基因DsRab，并初步證明該基因與鹽藻耐鹽性有關，為進一步研究 DsRab 蛋白在鹽藻抗鹽應答中的作用，獲得高純度的可溶性的 DsRab 蛋白是非常重要的。
本試驗中融合蛋白的表達選用經典的大腸桿菌原核表達系統，表達的融合蛋白在細胞的上清和沉淀中均有存在，說明融合蛋白以可溶性及包涵體形式表達。為了獲得大量的可溶性蛋白，對誘導劑濃度和誘導溫度兩個表達條件進行了優化。其中誘導劑IPTG 在 0.1-1.0 mmol/L 范圍內，融合蛋白表達量相差不大，為盡可能減少包涵體形式的蛋白表達，誘導劑的濃度越小越好。試驗中的 5 個誘導溫度比較，28℃時蛋白的表達量最大。所以確定的最優表達條件是 0.1 mmol/L IPTG，28℃，誘導培養 6 h。
本試驗中純化的可溶性 DsRab 蛋白可以用于篩選與該蛋白可能發生相互作用的蛋白質，進一步了解 DsRab 上下游的作用因子。為深入研究鹽藻DsRab 蛋白在抗鹽方面的作用，也可以在轉基因的植物中過量表達該蛋白，檢測轉基因植物的高鹽適應性。這些結果，不僅為下一步制備抗體并進一步研究 DsRab 蛋白在鹽藻耐鹽機制中的作用奠定了基礎，而且為該類蛋白在植物抗逆中的作用提供了新的信息。
4、結論
成功的構建了鹽藻 DsRab 蛋白的原核表達載體pGS-21a-DsRab，并在大腸桿菌 E.coliBL21（DE3）表達體系中成功表達，優化誘導表達條件后，純化上清蛋白，獲得了純度較高的可溶性融合蛋白。Western blot 初步證明該融合蛋白就是帶有 GST 標簽的 DsRab 蛋白。
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