20 世紀 40 年代第一個抗生素藥品—青霉素的出現開創了人類治療疾病的新時代,經過 70 余年的不斷完善,各種抗生素相繼問世增強了人類對傳染性疾病的抵抗力。然而隨著抗生素藥物的廣泛和大量使用,細菌的耐藥問題也日趨嚴重。細菌抗生素耐藥能力的不斷上升以及耐藥相關基因在不同病原菌間的傳播已經成為臨床感染性疾病治療的難題。對當前幾乎所有臨床用抗生素均產生耐藥性的“超級細菌”越來越頻繁的出現更引發了社會對抗生素濫用和細菌耐藥問題的擔擾,這一問題已引起多國政府和衛生部門的高度重視。實際上近 30 年來,細菌耐藥性的研究一直是醫學微生物研究的熱點,而細菌的耐藥性研究先后導致了耐藥質粒、整合子、整合性接合元件等可移動遺傳元件\\( mobile genetic elements,MGE\\)的發現,它們是細菌耐藥基因以及其它細菌適應性功能基因水平轉移的主要載體。

1、 SXT /R391 元件的發現

20 世紀 90 年代以前,世界范圍內流行的霍亂均由01 群霍亂弧菌\\( Vibrio cholorae\\) 引起,1992 年從印度和孟加拉國爆發的霍亂迅速波及到周邊十幾個國家和地區,引發此次霍亂爆發的 O139 群霍亂弧菌除了代表一種新的血清群外,另一個顯著特點是對磺胺甲基異惡唑、甲氧芐啶、鏈霉素、氯霉素耐藥。O139 群霍亂弧菌的典型株 MO10 的耐藥性是由其染色體上一種可自我轉移的遺傳元件 SXT 介導的,在此之前并未在霍亂弧菌中發現此類元件。后來發現 1972 年分離自南非的雷氏普羅威登斯菌\\( Providenciarettgeri\\) 所攜帶的“F 因子”實質上是一種與 STX 密切相關的可自我轉移的遺傳元件,命名為 R391,R391 賦予宿主卡那霉素耐藥性及重金屬離子 Hg2 +抗性。SXT、R391 以及后來發現的多個相關的元件具有高度類似的保守骨架結構,以及固定的染色體插入/重組位點,因此被劃分為同一個SXT / R391 家族。2011 年,Mata 等發現: 19 個對大環內酯類抗生素耐藥的奇異變形桿菌 \\( Proteusmirabilis\\) 臨床株中,有 7 株\\( 37% \\) 攜帶 SXT / R391,這是第一次報道 SXT/R391 廣泛存在于奇異變形桿菌臨床株中,并且耐藥基因 blaCMY-2位于 SXT/R391 中。

截止到2012 年,在臨床和環境的細菌株中超過 40 個SXT / R391 被發現。SXT/R391 是整合性接合元件\\( Integrating conjugative elements,ICE\\) 家族中一個類別,ICE 是一類可自我轉移的遺傳元件,它們可自主從宿主染色體剪切并通過宿主與受體菌接合形成的通道進入受體菌,然后整合到受體菌的染色體上。SXT/R391 家族目前已經 ICE 元件中多樣性最為豐富、成員最多的一個家族。

2、 SXT /R391 結構、基因功能

通過對 13 個不同來源的 SXT/R391 。完全序列的比較以及其它 ICE 的認識,Wozniak 等確定了SXT / R391 保守的核心骨架結構、部分保守基因功能以及外源 DNA 的插入位點\\( 圖 1\\) 。SXT/R391 保守的核心區域主要涉及 SXT/R391 的整合/剪切、接合轉移、元件表達調節。整合酶 Int 負責 SXT/R391 位點特異性整合; xis 的編碼產物為重組定向因子 Xis。在 Xis 協助下,Int 也負責 SXT/R391 位點特異性剪切; RumAB 負責趨錯 DNA 的修復。

oriT 為 SXT / R391 轉移的起始位點,為保守的順式作用元件,長 299bp,位于保守的基因 s003 與 mobI之間,在解旋酶 TraI 的作用下,環形的雙鏈 DNA 在此處形成缺口,并最終形成可以通過接合孔隙的單鏈 DNA。位于 oriT 下游的 mobI,為轉移過程必需基因,其功能與 oriT 識別有關。一系列 Tra基因則涉及 SXT/R391 接合和轉移的過程,包括DNA 加工以及 DNA 輸出的交配孔道形成、單鏈DNA 運輸等。Bet、Exo 負責 SXT/R391 間的重組,traG、eex 則為編碼排斥系統的基因,用于阻止相同拷貝的 SXT/R391 在同一個宿主細胞中出現。SXT/R391 核心區還包括一些未知功能基因,研究發現即使所有這些未知功能基因全部缺失也不會影響 SXT/R391 的轉移頻率,因此推測核心區這部分未知功能的基因可能與增強 SXT/R391 的適應性有關SXT / R391 有 5 個區域為可變的外源 DNA 經常插入的區域,稱為熱點區域 HS1-HS5\\( 圖 1\\) 。

此外,在一些 SXT/R391 也發現了其它的插入外源DNA 的區域,目前已經鑒定出 4 個這樣的區域,命名為 VRⅠ-VR Ⅳ\\( 圖 1\\)。這些可變區在每一個元件中的總長度可以達到 30 -60 Kb。目前發現 SXT/R391 可變區基因的常見的編碼產物主要負責宿 主對抗生素的耐藥性、重金屬離子抗性、生物膜形成和細菌運動能力的調節,另外也編碼毒素-抗毒素系統以阻止 ICE 從宿主丟失。此外,一些 SXT/R391 的可變區還具有其它一些功能,例如: 編碼限制性修飾系統、解旋酶、核酸內切酶,它們的作用可能是阻礙外源 DNA 的入侵或者保持 ICE 轉移期間的完整性。Balado 等通過噬菌體感染實驗證實了 2 株不同種弧菌中的SXT / R391ICEVspPor3 and ICEValSpa1 具備有活性的限制性修飾系統,它們阻止外源 DNA 的入侵。

Bordeleau 等在霍亂弧菌中發現有 3 個 SXT/R391 包含編碼二鳥苷酸環化酶的基因,二鳥苷酸環化酶催化 c-di-GMP 的生成,c-di-GMP 調節生物膜的形成、運動能力以及毒力。但是迄今為止,還沒有在SXT / R391 中發現直接的毒力基因。 Rodríguez-Blanco 等在 Enterovibrionigricans 中首次發現 SXT/R391 包含對季胺鹽類化學消毒劑具有耐受性的基因 qac,擴展了對 SXT/R391 功能的認識。當然,我們也不排除可變區的一些基因為潛在的抗生素耐藥性提供編碼,因為抗生素的使用歷史僅幾十年,而耐藥基因的出現和進化不可能在幾十年內完成。目前已知的 SXT 多數包含耐藥基因 strB、sull、floR、dfrA,分別提供鏈霉素、磺胺甲基異惡唑、氯霉素、甲氧芐啶抗性,R391 包含卡那霉素耐藥基因。但在SXT / R391 中也逐漸發現了一些新的耐藥基因,例如: 頭孢菌素耐藥基因 blaCMY-2和利福平耐藥基因。SXT/R391 的大多數耐藥基因位于復合轉座子或整合子的基因盒中。轉座子和整合子種類多樣、攜帶的耐藥基因高度多樣化,因此我們相信未來還會在 SXT/R391 中發現更多的耐藥基因。

3、 SXT /R391 調控及環境因子對其轉移的影響

在整個 SXT/R391 調控中,SetC/SetD 是最關鍵的轉錄激活蛋白,研究表明至少它們是 int 以及系列tra 基因轉錄的激活蛋白,setC/setD 的轉錄則受到一種與 λ 噬菌體阻遏蛋白 cI 高度相似的 SetR 阻遏蛋白的抑制。Beader 等發現: 霍亂弧菌MO10 的 SXT 中 setCD、setR 分屬于不同的操縱子,二者的啟動子\\( PL、PR\\) 位于 s086\\( setCD 上游,同屬1個操縱子\\) 與 setR 基因之間,SetR 可與和 s086 間 3個位點結合\\( 操縱序列\\) 控制轉錄活性。SetR 也與自身啟動子 PR下游操縱序列結合,表明 setR 的表達是自我抑制的,setR 基因無 SD 序列。setCD、setR 操縱子的這些結構和調控特征完全類似于 λ 噬菌體溶原/非溶原開關系統的結構與調控特征。

SetCD 是 1 個很強的激活蛋白,不僅激活 SXT 相關基因的轉錄,對一些帶有 int 基因的 MGE,SetCD 也可以激活其整合酶基因轉錄,從而促進轉移,例如:SetCD 的激活也驅動宿主基因島的轉移,這主要是SetCD 對基因島 int 及 rdfM 的激活所致。SXT / R391 的轉移受環境因子影響明顯。一些可以引起 DNA 損傷的環境因子\\( 如: 絲裂霉素 C、紫外照射、環丙沙星\\) 均可明顯增加 SXT/R391 的轉移頻率。這些 DNA 損傷環境因子可引起細菌的SOS 反應,進而激活 RecA 活性,類似于 RecA 對LexA 阻遏物的水解,RecA 對 SXT / R391 的 setCD 阻遏蛋白 SetR 也產生水解作用,進而激活了 setCD 表達,SXT/R391 得以高頻轉移。

4、 SXT /R391 接合轉移過程

SXT /R391 的接合轉移過程如圖 2 所示。在 Int和 Xis 的作用下,SXT/R391 從供體菌的染色體 prfC位點剪切,形成線性的 SXT/R391 分子,它的二端分別是具有正向重復的 attL 和 attR 位點,因此二端可以重組,形成新的 attP 位點,線性的 SXT/R391 分子完成環化。oriT 在 1 個解旋酶 TraI 的作用下形成 1個切口,從這個切口開始解鏈成一個單鏈 DNA,該單鏈 DNA 可以通過供體菌和受體菌接合形成的接合通道\\( 系統\\) 進入受體菌細胞。SXT/R391等 ICE 也為接合系統編碼,推測幾乎所有的 ICE 都采用該系統進行 ICE 的轉移,該接合系統類似于 IV型分泌系統。IV 型分泌系統組成 1 個蛋白復合物,包含了細胞外的成分,例如: 鞭毛。IV 型分泌系統形成一個跨膜的分泌通道,用于蛋白轉運或者與環境中的 DNA 交流。進入受體菌的單鏈DNA 在受體菌 DNA 聚合酶的作用下再次組裝成雙鏈的環形分子,該雙鏈 DNA 分子可以在 Int 的作用下整合入受體菌的特異位點\\( 通常是在 prfC 基因前\\) ,此時環形分子的 attP 位點與受體菌染色體的attB 位點也完成重組,產生新的染色體 attB 位點。此外,在原供體菌中,殘留的單鏈的 DNA 再次形成雙鏈,然后重新整合入供體菌的染色體,從而完成 SXT/R391 接合轉移過程,在這個過程中 SXT/ R391 并不會因為轉移而從原供體菌丟失。

5、 SXT /R391 在宿主系統的穩定性及重組

SXT / R391 并不會輕易從宿主染色體丟失,大多數的 SXT/R391 的熱點區 HS2 都包含 mosA 和mosT 基因,它們為毒素-抗毒素系統編碼,研究表明包含毒素-抗毒素系統的 SXT 通過殺死或者抑制丟失 SXT 的細胞而維持其存在。一些不存在mosA 和 mosT 基因的 SXT / R391,可能會編碼其它類似的 基因來維持其穩定性例如在 R391 和ICEVchMex1\\( STX 的一種\\) 中都包含 2 個類似功能的基因\\( orf1 和 orf3\\) ,它們 1 個編碼 HipA 樣的毒素,另1 個編碼與抗毒素 HipB 親緣關系較遠的轉錄抑制子。

SXT / R391 等 ICE 可以阻止細胞再次獲得密切相關的同類 ICE,稱之為進入排斥。SXT/R391可以劃分為 2 種排斥類群,分別為 S 群和 R 群,擁有 S 群的宿主會阻止再次獲得另一個屬于 S 群的ICE,但不阻止對 R 群 ICE 的獲得,反過來也是一樣,Eex 對相同類群拷貝的排斥起主導作用,內膜配對形成蛋白 TraG 參與其中。不同類群的不排斥性造成宿主中的 ICE 可以形成串聯排列。

實質上,當一個細胞同時進入 SXT 和 R391 型ICE,并形成串聯排列時,二者并不能穩定存在,而是發生重組形成雜合 ICE。后來發現,SXT/R391不僅有整合、剪切、轉移系統,還自帶類似 λRed 重組系統。bet\\( s065\\) 、exo\\( s066\\) 是這個系統的 2個關鍵基因,bet 產物 Exo 是核酸外切酶,結合在雙鏈 DNA 末端,降解 DNA 使之產生 3’突擊端; exo 產物 Bet 蛋白結合在單鏈 DNA 上,介導互補單鏈 DNA退火。與 λRed 重組系統不同,SXT/R391 的重組系統沒有基因 gam。然而 SXT/R39 的重組系統更為復雜,bet、exo 位于 1 個大的操縱子之中,這個操縱子還包含 12 個其它的保守基因,其啟動子位于基因 s063、s089 之間。bet 上游有 1 個 ssb 基因,主要抑制 Bet/Exo 活性,此外 bet 上游還有 1 個衰減子,抑制重組系統轉錄。如前所述,引起 DNA 損傷的物理、化學因子可以造成 SXT/R391 轉移頻率的明顯增加,實驗還發現引起 DNA 損傷的絲裂霉素C 也可以引起 bet、exo 表達量的明顯增加,進而促進重組的發生,與 SXT/R391 轉移的誘導不同,DNA損傷因子對 bet、exo 的誘導是非 RecA 依賴的。這從側面反映了 bet、exo 操縱子調節的復雜性。

SXT / R391 的重組系統促進了雜合 ICE 的形成,SXT / R391 雜合賦予了宿主新的表型特征\\( 如: 新的耐藥性狀\\) ,增加了 SXT/R391 的多樣性,因此對于SXT / R391 的進化具有重要意義。

6、 SXT /R391 的廣泛轉移及分子機制

宿主范圍是衡量 1 個傳播耐藥基因的 MGE 影響力的關鍵因子。在實驗室條件下,SXT/R391顯示了相當高的轉移頻率和寬廣宿主范圍。例如:

O139 霍亂弧菌株的 SXT 可以轉移到大腸桿菌\\( Escherichia coli\\) 中,轉移頻率約為 10- 6/ 受體菌; 美人魚發光桿菌\\( Photobacteriumdamsela\\) 的ICEPdaSpa1 不僅可以轉移到發光桿菌屬的細菌中,也可以轉移到大腸桿菌中; 在奇異變形桿菌中發現的 SXT/R391 家族的 ICEPmiJpn1,能夠轉移到大腸桿菌、肺炎克雷伯氏桿菌\\( Klebsiellapneumoniae\\) 、腸沙門氏桿菌 \\( Salmonella enterica \\) 以 及Cirobacterkoseri 中,從而賦予這幾種受體菌對頭孢菌素的耐藥性; 燦爛弧菌 \\( Vibrio splendidus\\) 、Enterovibrionigricans 的 SXT / R391 也可以轉移到大腸桿菌中,并賦予其相應的耐藥表型,轉移頻率介于10- 5- 10- 6/ 受體菌。從中可以看出,雖然供體菌和受體菌的親緣關系很遠,但仍然具有相當高的轉移頻率。我們推測 SXT/R391 具有廣泛的宿主范圍主要由 3 種原因引起: 第一,決定 SXT/R391 是否轉移的關鍵因素在于受體菌是否具有與其 attP 位點相似的 attB 位點,當存在 attB 位點時就可以發生轉移,轉移與細菌的種屬沒有明顯關系。根據 SXT/R391 對 attB 位點的識別特征,加拿大 Burrus 實驗室研究人員已經在多個載體或菌株中人為引入 attB位點,用于定點捕獲 SXT/R391\\( 未出版\\) ; 第二,attB位點并非要求完全與 attP 相同,研究顯示 SXT/R391 attP 位點與受體菌 attB 位點可以允許高達23. 5% 的錯配; 第三,我們通過對已知的 attL 和attR 排列后發現,不同 SXT / R391 的 attL\\( 或 attR\\) 長度不超過 17bp\\( 未出版\\) ,較短的 attL、attR\\( SXT/R391 環化后形成 attB\\) 無疑加大了 SXT / R391 匹配到整合位點機率。由于 SXT/R391 具有高的轉移頻率、潛在的廣泛宿主范圍,我們推測 SXT/R391 具有迅速傳播并擴大分布區域的趨勢。

7、 SXT /R391 的擴散趨勢及潛在危害

如前所述,目前已經有超過 40 個 SXT/R391 被發現,包括普羅維登斯菌、發光桿菌、施萬氏菌、變形桿菌以及弧菌屬的多個物種,以弧菌中發現最多。

2006 年,Burrus 等根據已經報道的攜帶 SXT/R391 的細菌株分離地點,描繪了 SXT / R391 的世界分布圖\\( 圖 3\\) 。從圖中可以看出,已知的 SXT/R391主要出現在非洲和亞洲,而美洲、歐洲、大洋洲則幾乎沒有報道; 無論臨床株還是環境分離株,所有的SXT / R391 均出現在沿海地帶,這一結果結合 SXT /R391 的來源菌多為海洋細菌,顯然說明海洋環境很可能是 SXT/R391 發源地,也是其目前主要的貯藏庫,并且經由海洋環境株向臨床株擴散。目前,SXT / R391 主要出現在非洲和亞洲,并沒有呈現出世界性分布,結合 SXT/R391 的轉移特征,我們推測SXT / R391 很可能仍然處在一個擴大分布范圍的過程中。2012 年,Rodríguez-Blanco 等發現: 2002 至2010 年分離 自西班牙的溶藻弧菌\\( Vibrioalginolyticus \\) 、 燦 爛 弧 菌、 Vibrio scophihalmi、Shewanellahaliotis、Enterovibrionigricans 的 498 株細菌中有 12 株攜帶 SXT/R391\\( 2. 4%\\) ; 令人感興趣的是 2009 -2010 年分離的菌株雖然只占到總菌株數的 16.6%,但是卻有一半的 SXT/R391來源其中,這一結果表明日益增加的選擇壓力很可能加速了 SXT/R391 的傳播。2004 年,Beaber 等在 Nature 發表文章指出: 1993 年以前從未在霍亂弧菌中發現 SXT 元件,但是僅僅 10 年時間,幾乎所有的臨床霍亂弧菌株都攜帶有 SXT/R391,這表明SXT / R391 的水平轉移相當迅速; Beaber 等同時證實: 無論霍亂弧菌或 SXT 受體菌大腸桿菌都會在SOS 反應的刺激下明顯增加 SXT 的轉移頻率。例如: 絲裂霉素 C 和喹諾酮類藥物環丙沙星的使用可以造成 SXT 的轉移頻率增加幾百倍以上。因此Beaber 等指出: 喹諾酮類抗生素\\( 如: 環丙沙星\\)的廣泛使用可能會促使 SXT 及相關 ICE 的廣泛傳播。Beaber 等的報道警示我們應當謹慎對待喹諾酮類以及其它抗生素藥物的使用問題。同時我們也不排除其它的一些引起細菌 DNA 損傷的物理、化學因子可以促進 ICE 的傳播。

喹諾酮類藥物是近 30 年才被廣泛使用的抗生素,屬當前主流的抗生素種類。結合 Rodríguez-Blanco 等、Beaber 等的研究結果以及 SXT/R391 分布特征分析,我們有理由推測喹諾酮類等抗生素的廣泛使用,很有可能造成攜帶 SXT/R391 的細菌在臨床和環境中出現的頻率逐漸增高,并且借助海洋水流以及人口流動,含 SXT/R391 的細菌株勢必會在全球擴散。2012 年,我們對2006 - 2009 年從華南沿海分離的 192 株溶藻弧菌攜帶 SXT/R391 的情況進行了調查,結果發現 17 個株 SXT/R391 檢測陽性,出現比例達 8. 9%,種系發生分析表明溶藻弧菌 SXT/R391 部分序列與 5 個細菌屬的 SXT/R391 高度相似,這 5 個屬分別是弧菌屬、普羅威登斯菌屬、變形桿菌屬、發光桿菌屬、施萬氏菌屬。本結果表明華南沿海分離的溶藻弧菌SXT / R391 不僅出現比例高,而且元件本身的多樣性豐富,這是第一次報道溶藻弧菌中存在 SXT/R391。Rodríguez-Blanco 等的報道中也有 1 株溶藻弧菌攜帶 SXT,但 SXT/R391 出現率明顯低于我們的報道。2013 年筆者對加拿大東西海岸分離的總計 289 株溶藻弧菌、副溶血弧菌、創傷弧菌\\( 分離于 2008 - 2011 年\\) SXT/R391 攜帶情況進行調查,沒有發現其攜帶 SXT/R391\\( 未出版\\) 。在華南沿海分離溶藻弧菌中 SXT/R391 的高出現率表明SXT / R391 很可能已經在中國以及周邊國家的海洋中盛行。值得注意的是: SXT/R391 不僅能夠實現自我轉移,還可以通過共整合的方式,驅動與之沒有任何遺傳關聯的質粒和染色體基因島的轉移。質粒不僅可以攜帶耐藥基因,也可以攜帶毒力基因; 一些重要細菌病原的關鍵毒力因子也被發現位于基因島上,如: 霍亂弧菌、副溶血弧菌、大腸桿菌等,因此 SXT/R391 也可能促進毒力因子的擴散。鑒于 SXT/R391 等 ICE 轉移和盛行帶來的風險,衛生部門以及醫學微生物科學家應對其擴散保持充分警惕。

8、 問題和展望

在抗生素藥物使用的 70 余年里,人類已經向地球生物圈輸入了大量的抗生素以及其它化學藥物,它們已經顯著改變了微生物賴以生存的環境,破壞了微生物間長期天然存在的拮抗平衡,微生物也通過自身的調整來適應這種變化。通過一系列機制捕獲耐藥以及其它利益化的基因是細菌對環境做出適應性的表現,同時也是細菌進化的一種重要驅動力。因此,抗生素藥物的廣泛使用、濫用及不合理處置是攜帶耐藥基因的可移動元件廣泛傳播,新耐藥菌、超級細菌頻現的幕后推手?？股仡愃幬镌谌祟惐粸E用的情況可能還不是最嚴重的問題,養殖業才是抗生素藥物濫用的重災區,除了少數發達國家,養殖業中抗生素藥物的濫用更為普遍,而且養殖廢水、廢物的排放也沒有嚴格的管制,這種情況在中國尤為嚴重。這些現狀可能是耐藥基因傳播、環境細菌廣泛產生耐藥性的問題根源。絕大多數的 SXT/R391 攜帶株出現在亞洲和非洲地區似乎與這些地區過度使用抗生素以及比較隨意的排放含抗生素污水存在聯系,這也是一個值得探索的問題。

SXT /R391 可以攜帶多種耐藥基因以及其它未知功能的基因,并且具有很強的自我轉移頻率,SXT / R391 潛在的宿主范圍寬廣。SXT / R391 具有多個外源 DNA 插入位點,外源 DNA 形成的可變區在每一個元件中的總長度可以達到 30 -60 kb,比起質粒,SXT/R391 顯然具有更強的容納外源 DNA 的能力,目前已知的 SXT/R391 通常攜帶 4 種耐藥基因,但是我們推測在環境選擇壓力下,SXT/R391 完全可能捕獲更多的耐藥基因以及其它可以賦予宿主抗逆功能的基因,如果沒有充分的認識以及必要防范措施,以 SXT/R391 為載體的更多新型耐藥菌株甚至超級細菌的頻現將會成為趨勢。雖然我們搞清楚了 SXT/R391 的基本結構以及部分基因的功能,但是對于它仍然知之甚少,因此還需要持續不斷的探索。