0、引言

STK11\\(serine/threonine kinase 11,STK11\\)基因最早是從Peutz-Jeghers 綜合征\\(Peutz-Jegherssyndrome, PJS\\)患者中發現的,目前被認為是一種抑癌基因,參與多個生物學過程和信號通路。我們構建含目的基因STK11的EGFP融合載體轉染A549和H460細胞,并探討其對肺癌細胞遷移能力的影響。

1、材料與方法

1.1 材料

健康者胚腎細胞系293和人肺癌細胞株A549、H460細胞、EGFP-N1、大腸埃希菌DH5α由徐州醫學院腫瘤生物治療實驗室保存;人H460細胞購買于南京凱基生物有限公司;引物合成及測序工作由上海生工生物工程技術服務有限公司完成;RPMI 1640培養液購自賽默飛世爾生物化學有限公司;胎牛血清購于浙江天杭生物科技公司;限制性內切酶、連接酶、RT-PCRKit Ver.2試劑盒、凝膠回收試劑盒、質粒中量提取試劑盒均購自北京TIANGEN公司;脂質體\\(lipofectamine 2000\\) 購于Invitrogen 公司;STK11抗體、辣根過氧化物酶標記的二抗購于abcam公司。

1.2 引物設計及STK11基因擴增

根據GenBank的LKB1基因序列\\(NM000455.4\\),利用Primer predict和DNAclub軟件設計引物,引物由上海英俊生物技術有限公司合成。引物上下游分別引入HindⅢ/KpnⅠ酶切位點。上游引物:5’-ATAGCTAGCATGGAGGTGGTGGACCCG-3’,下游引物:5’-AGAGAATTCCTGCTGCTTGCAGGCC-3’。

按照Trizol試劑盒說明書,從293細胞中提取總RNA,獲得STK11全長。

1.3 重組質粒構建及鑒定

將末端加A后的目的基因STK11連接到PMD18-T載體上,得到pMD18-T-STK11重組質粒。分別雙酶切質粒pEGFP-N1和pMD18-T-STK11,獲得pEGFP-STK11重組質粒。用含陽性克隆的細菌抽提質粒,對質粒pEGFP-STK11進行NheⅠ和EcoRⅠ雙酶切,37℃、2h,1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。重組質粒送交上海英俊生物技術有限公司進行基因測序,將測序結果與質粒中插入序列的ORF對比,驗證重組質粒插入片段的正確性。

1.4 轉染及實驗分組

轉染前一天,將處于對數生長期的細胞用0.25%胰酶消化,分別將A549和H460細胞濃度調整至為\\(2~5\\)×107cells/ml,接種至6孔板,待細胞鋪滿板底80%~90%時,按照Lipofectamine 2000轉染試劑說明書進行轉染。實驗分pEGFP-STK11重組質粒轉染組和0.9%氯化鈉溶液對照組。每組6個復孔。

1.5 熒光顯微鏡觀測和Western blot檢測

在轉染后12、24、48和72 h熒光顯微鏡下分別觀測兩組細胞EGFP的表達情況。分別在轉染后24、48和72 h收集細胞,按照細胞蛋白提取試劑盒要求提取蛋白, 80℃冰箱保存,Western blot檢測STK11蛋白表達。

1.6 劃痕實驗

在6孔板背面畫平行直線做標記,每孔3條。

分別將兩組細胞常規消化后,5×105細胞/孔種植到6孔板內過夜,待細胞基本融合達到80%時,棄去培養液,用PBS清洗三遍后,用10 μl微量移液頭在6孔板內垂直于標記縱向劃痕,PBS沖洗3次去除細胞,加入無血清培養液繼續培養。倒置顯微鏡下,在3個不同的劃痕部位拍照,48h后在同樣的位置再拍照觀察創傷愈合情況,應用Photoshop軟件計算劃痕間距。實驗重復3次,細胞遷移率=\\(劃痕后即刻測量的劃痕間距-劃痕后48 h測量的劃痕間距\\)/劃痕后即刻測量的劃痕間距×100%。

1.7 統計學方法

應用SPSS19.0軟件對實驗數據進行統計分析。統計描述、均數采用x±s表示,兩組間均數比較采用t檢驗,P<0.05為差異有統計學意義。

2、結果

2.1 重組質粒鑒定

酶切鑒定結果顯示在1 300 bp左右出現條帶,與STK11基因大小相同,見圖1。對pEGFP-STK11插入片段進行測序,結果顯示插入序列無突變,與GenBank中STK11序列一致。

2.2 EGFP 表達和STK11基因蛋白表達

A549細胞和H460細胞在轉染后各時間點,熒光顯微鏡下均可見pEGFP-STK11重組質粒組細胞呈綠色,細胞形態完好,在轉染后24 h EGFP表達最強,見圖2;0.9%氯化鈉溶液對照組細胞在轉染后各時間點,熒光顯微鏡下均未觀察到綠色熒光。在轉染后各時間點,Western blot檢測結果均顯示與目的蛋白分子量一致的目的條帶,24 h時條帶顏色最深;而0.9%氯化鈉溶液對照組未見目的條帶表達,見圖3。

2.3 劃痕實驗檢測細胞遷移能力

與劃痕后即刻測量相比,各組細胞在劃痕后48 h,劃痕距離均明顯縮小,有融合的趨勢,見圖4。兩種細胞均顯示pEGFP-STK1重組質粒轉染組劃痕較0.9%氯化鈉溶液對照組細胞愈合慢,轉染組細胞遷移率小于0.9%氯化鈉溶液對照組,差異有統計學意義\\(P<0.05\\),且H460細胞遷移率小于A549細胞,見表1。

3、討論

STK11基因位于人類染色體19p13.3區域上,DNA全長2155 bp,編碼區含1302 bp,包括9個外顯子,其轉錄的mRNA約3.0 kb。STK11編碼的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶包含433個氨基酸殘基,功能結構域包含一個激酶區域和氨基端非催化區域的核定位信號通路。STK11雖然最早在PJS綜合癥中發現,但是有文獻報道其在非小細胞肺癌中也有散發性突變,突變率高達30%。據文獻報道,我們選擇的H460和A549肺癌細胞株STK11基因存在37密碼子突變,無STK11蛋白表達。

針對這兩種細胞株進行STK11重組質粒轉染,使之過表達,更有利于研究STK11基因的生物學功能。對我們構建的重組質粒雙酶切瓊脂電泳可顯示1 302 bp的目的基因條帶,基因測序與GenBank中STK11序列一致,提示STK11重組質粒成功構建。熒光顯微鏡檢測pEGFP-STK11重組質粒轉染組細胞EGFP表達,也提示STK11重組質粒成功構建。Western blot結果顯示轉染后細胞有STK11蛋白條帶出現,表明重組質粒在細胞內正確表達。

STK11基因調節多項生物學過程包括細胞生長、細胞周期、極化、轉移和能量代謝。高益軍等報道STK11通過下游mTOR-HIF-1α信號通路調控腫瘤轉移相關基因LOX\\(lysyl oxidase\\)而介導肺癌的轉移,LOX上調可激活β-1-integrin信號通路,增強細胞的侵襲能力。文獻報道,在臨床上觀察到發生遠處轉移的肺癌患者中STK11突變率增高。我們的細胞劃痕實驗提示,重組質粒轉染組細胞有細胞劃痕愈合減慢的現象,初步證實STK11有抑制肺癌遷移作用。我們下一步會采用Transwell等方法進一步驗證STK11基因的遷移抑制作用,并通過檢測Lox、Pdgf R和Vegfc等轉移基因來探討其可能機制。