染色質的基本結構是核小體，由約１４７ｂｐＤＮＡ纏繞在Ｈ２Ａ，Ｈ２Ｂ，Ｈ３，Ｈ４各兩分子形成的組蛋白八聚體構成．研究染色質的結構對于揭示真核生物基因表達調控的機理有著重要意義．但是在體內真核生物的染色質的形成會受到各種因素的干擾，在體外將ＤＮＡ和組蛋白組裝成核小體結構可以排除這些因素的影響來模擬核小體的形成，而且體外將一段短的ＤＮＡ片斷重構到組蛋白八聚體上，其核小體定位主要取決于纏繞的ＤＮＡ序列特性．此外，通過染色質體外組裝系統，可以將不同修飾狀態的組蛋白和特定ＤＮＡ模板組裝成染色質結構，進而進行體外轉錄實驗，研究組蛋白的不同修飾狀態以及組蛋白變體等對基因轉錄的表觀遺傳調控作用．因此，為了更好得研究基因表達調控的機理，進行染色質的體外組裝是有必要的．目前，染色質體外組裝主要有兩種方式：一種是采用鹽透析的方法，另一種是依賴ＡＴＰ及蛋白因子（ｄＮＡＰＩ和ＡＣＦ）進行的染色體體外組裝．本實驗構建了含目的片段６０１及ＥＳ１，ＣＳ１序列的質粒，運用ＰＣＲ的方法獲得了目的片段，利用鹽透析法進行了體外組裝核小體結構并用Ｂｉｏｔｉｎ標記法和ＥＢ染色法進行了檢測．
１材料與方法
１．１材料
１．１．１試驗菌株
大腸桿菌ＤＨ５α由本實驗室保存，重組質粒ｐＵＣＣＳ１，ｐＵＣＥＳ１，ｐＵＣ６０１由本實驗室構建．
１．１．２試劑和儀器
質粒小提試劑盒、膠回收試劑盒購自上海生工，Ｔａｑ酶、限制性內切酶，Ｔ４ＤＮＡ連接酶購自ＴａＫａＲａ公司，Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ－ａｌｋａｌｉｎｅ－ＡＰ，ＣＤＰ－Ｓｔａｒ－ＣＤＰ購自羅氏公司．
１．２方法
１．２．１質粒的構建
（１）含目的片段質粒的構建ＤＮＡ片段ＣＳ１和ＥＳ１分別為：
ＣＳ１：ＣＧＧＧＡＡＴＴＴＣＴＣＧＧＡＧＡＴＴＣＴＣＧＧＡＧＧＴＴＣＣＴＧＡＧＡＧＧＴＣＴＴＣＧＡＡＧＧＣＴＴＴＣＡＧＧＧＡＴＣＣＴＴＣＡＧＡＧＧＣＴＴＣＣＡＧＡＧＧＣＴＣＴＴＧＡＧＧＧＡＣＣＴＴＴＧＧＧＡＡＴＴＴＣＣＧＡＡＧＧＴＣＣＴＴＣＡ
ＥＳ１：ＴＧＣＴＧＧＣＡＧＣＡＣＴＧＧＴＧＣＣＣＧＴＧＣＴＧＣＣＡＧＣＡＣＴＧＣＴＧＣＣＡＧＴＧＣＴＧＣＣＡＧＣＡＣＧＧＧＣＡＧＣＡＧＴＧＣＴＧＧＣＡＧＣＡＣＧＧＧＣＡＣＣＡＧＴＧＣＴＧＣＣＡＧＣＡＣＧＧＧＣＡＣＣＡＧＴＧＣＴＧＣＣＡＧＣＡＣＧＧＧＣＡＣ－ＣＡＧＴＧＧＴＧＣＣＡＧＴＧＣＴＧＧＣＡＣＣＡＣ
ＤＮＡ片段化學合成后，連接到ｐＵＣ１９質粒的ＨｉｎｄＩＩＩ和ＥｃｏＲＩ兩酶切位點（上海生工合成克?。?br> （２）含６０１序列重組質粒的構建用ＢａｍＨＩ和ＰｓｔＩ雙酶切含有６０１序列的ｐｂｌｕｅ－ｓｃｒｉｐｔ重組質粒，分離６０１序列，酶切體系為：質粒ＤＮＡ１０μＬ，ＢｕｆｆｅｒＫ５μＬ，ＢＳＡ０．５μＬ，Ｂａｍ ＨＩ（２０Ｕ／μＬ）２μＬ，ＰｓｔＩ（１０Ｕ／μＬ）３μＬ，ｄｄＨ２Ｏ２９．５μＬ，總體系５０μＬ，３７℃酶切３ｈ；然后將切下的６０１ＤＮＡ序列連接到ｐＵＣ１９質粒的ＢａｍＨＩ和ＰｓｔＩ兩位點之間，酶連體系為：
６０１ＤＮＡ序列４μＬ，雙酶切回收后ｐＵＣ１９載體２．５μＬ，Ｔ４ｌｉｇａｓｅ１．５μＬ，Ｔ４ｂｕｆｆｅｒ１．５μＬ，ｄｄＨ２Ｏ５．５μＬ，總體系１５μＬ，１６ ℃酶連２０ｈ；?。处蹋烀高B產物轉入１００μＬＥ．ｃｏｌｉＤＨ５ａ中．挑取單克隆提取質粒進行酶切、測序鑒定．
１．２．２目的片段的獲得
分別設計６０１序列、ＥＳ１，ＣＳ１ＤＮＡ片段的ＰＣＲ擴增引物，由上海生工合成Ｂｉｏｔｉｎ標記與未標記的引物，引物的序列見表１．６０１ＤＮＡ序列ＰＣＲ擴增程序為：
９５ ℃ ５ ｍｉｎ；９５ ℃ ２０ｓ，５３ ℃ ２０ｓ，７２ ℃ ３０ｓ，３２個循環；７２ ℃１０ｍｉｎ；４℃保存．ＥＳ１，ＣＳ１ＤＮＡ片段ＰＣＲ擴增程序為：
９５ ℃ ５ｍｉｎ；９５ ℃ ２０ｓ；６２ ℃ ２０ｓ，７２ ℃ ３０ｓ，３２個循環；７２℃１０ｍｉｎ；４℃保存．用ＰＣＲ大量擴增獲得目的片段，?。郸蹋蹋校茫耶a物加入１．５％瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，其余用膠回收試劑盒回收目的片段，４０μＬＥｌｕｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒ回溶．
１．２．３組蛋白八聚體表達、純化與復性按參考文獻［８］中的方法分別表達四種組蛋白，純化后進行復性，同時裝配形成組蛋白八聚體．１．２．４體外組裝核小體。將純化的組蛋白八聚體與目的ＤＮＡ片段以一定的比例加入到含有２ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ的ＴＥ緩沖液中混勻，總體系８０μＬ，然后加入透析管（Ｔｈｅｒｍｏ，１００００ＭＷＣＯ）中，放入含２ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ的ＴＥ透析液中透析１６ｈ，在此過程中用恒流泵（ＨＬ－ＺＳ，上海青浦西儀器廠）將ＴＥ緩沖液勻速滴入透析液中，使其中ＮａＣｌ的濃度降到０．６ｍｏｌ／Ｌ；將透析管轉入到不含有ＮａＣｌ的ＴＥ緩沖液中透析３～６ｈ．１．２．５Ｂｉｏｔｉｎ標記檢測。
取組裝后含有１００ｎｇＤＮＡ的樣品進行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳，１１０Ｖ，３ｈ；然后在２５ｍＡ條件下轉膜３６ｍｉｎ；將轉好的膜放到紫外交聯儀中交聯，至焦耳數降到２焦耳；加封閉液（５％ ＳＤＳ，１２５ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ，１７ｍｍｏｌ／ＬＮａ２ＨＰＯ４，８ｍｍｏｌ／ＬＮａＨ２ＰＯ４）將膜封閉１ｈ；加入抗體放在水平搖床搖４５ｍｉｎ；加入清洗液（１００ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ－Ｃｌ，１００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ，１０ｍｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ２）洗５次，每次１０ｍｉｎ；加底物２００μＬ；將Ｘ光片曝光、洗片．１．２．６瓊脂糖凝膠電泳。組裝后樣品在１．５％的瓊脂糖凝膠中電泳，電泳后ＥＢ染色，凝膠成像儀拍照觀察分析．
２結果與分析
２．１重組質粒的構建
將理論設計的ＥＳ１，ＣＳ１序列及６０１序列片段插入ｐＵＣ１９質粒的多克隆位點后，由于質粒含有抗氨芐青霉素的基因，所以通過在含氨芐青霉素的固體平板上進行初篩，提取質粒后利用ＰＣＲ和酶切 的方法進行二次鑒定后，最后通過測序確定了構建重組質粒的正確性．
２．２目的片段的獲得
ＰＣＲ擴增ＣＳ１以及標記有ｂｉｏｔｉｎ的ＣＳ１－Ｂ目的片段，瓊脂糖凝膠進行電泳檢測的結果如圖１所示．目的片段為１５７ｂｐ，從圖中可以看出目的條帶介于１００ｂｐ～２００ｂｐ之間．將所有ＰＣＲ產物進行瓊脂糖凝膠電泳，回收后用于組裝核小體實驗．２．３組蛋白八聚體的體外構建。
分別將４種組蛋白表達純化后，用考馬斯亮藍法測定濃度，以等摩爾比例混合復性，用分子篩純化，純化后目的樣品用１５％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳檢測，結果如圖２所示．從圖中可以看出，樣品Ｃ２－Ｃ５濃度較高，而且每個泳道中從上到下依次為組蛋白Ｈ３，Ｈ２Ａ／Ｈ２Ｂ，Ｈ４，而且無雜蛋白混合，純度較高．２．４Ｂｉｏｔｉｎ標記檢測核小體取組裝后樣品各１００ｎｇＤＮＡ進行Ｂｉｏｔｉｎ標記檢測，結果如圖３所示，圖中０、０．８、１．２分別為組裝體系中組蛋白八聚體與ＤＮＡ的質量比．從圖中可看出未加組蛋白的泳道僅有ＤＮＡ條帶，而加入組蛋白的泳道都分別出現上下兩條帶，上方的條帶為形成的核小體，靠下的條帶為未形成核小體的游離ＤＮＡ，與未加組蛋白的對照位置相同．當加入的組蛋白與ＤＮＡ的比例不同時，組裝核小體的效率也不同，組蛋白與ＤＮＡ的比例為１．２的條帶明顯比０．８的條帶亮．此外從圖中也可以看出，序列ＥＳ１與組蛋白的結合能力差，同樣比例條件下形成核小體的能力明顯低于６０１序列與ＣＳ１序列．
２．５ＥＢ染色檢測核小體組裝后樣品利用瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖４所示，圖中０、０．８、１．２分別為組裝體系中組蛋白八聚體與ＤＮＡ的質量比．結果與利用Ｂｉｏｔｉｎ標記檢測結果類似，在加入組蛋白的樣品泳道中，分別出現兩條清晰的條帶，上面的條帶為形成的核小體，下面的條帶為游離的ＤＮＡ序列，而且組蛋白與ＤＮＡ的組裝比例越大，形成的核小體的條帶越深、游離的ＤＮＡ條帶越淺．
３討論
目前，染色質體外組裝方式中，相對于依賴ＡＴＰ及蛋白因子（ｄＮＡＰＩ和ＡＣＦ）進行的染色體體外組裝，鹽透析方法裝配染色質系統內只含有組蛋白和ＤＮＡ，不需要加入特殊的蛋白質，因此產生的染色質結構僅依賴于ＤＮＡ序列的核小體定位特性．本實驗以６０１序列為模板成功地利用鹽透析方法體外組裝了染色質結構，并分別運用Ｂｉｏｔｉｎ標記及ＥＢ染色兩種不同的方法進行檢測．目前一般實驗室ＥＢ染色能夠檢測到的ＤＮＡ至少需要２０ｎｇ以上，所以體外組裝核小體結構后，直接ＥＢ染色檢測電泳的靈敏度低，而且由于ＤＮＡ序列纏繞到組蛋白八聚體上形成了核小體結構，也會影響ＥＢ嵌入到ＤＮＡ雙鏈中的效率，但是ＥＢ染色檢測的方法也相對比較簡單，無需其他過程及設備．識別Ｂｉｏｔｉｎ的抗體專一性非常高，樣品中只有微量的Ｂｉｏｔｉｎ標記的ＤＮＡ序列存在，該抗體就可以專一性的識別，所以Ｂｉｏｔｉｎ標記檢測法靈敏度較高，但檢測過程較為復雜，需要進行轉膜、抗體識別、底物反應、曝光等操作，費用也較ＥＢ染色昂貴．本工作為研究核小體定位、組蛋白修飾、組蛋白變體等表觀遺傳問題以及轉錄因子的結合和轉錄調控機制等多種生物學過程奠定了基礎．致謝：組蛋白的表達、純化與復性以及八聚體的裝配在中國科學院生物物理研究所李國紅課題組完成，感謝李國紅研究員給予的幫助與指導．
參考文獻
［１］蔡祿，趙秀娟．核小體定位研究進展［Ｊ］．生物物理學報，２００９，２５（６）：３８５－３９５．
［２］ＬｉＧ，ＲｅｉｎｂｅｒｇＤ．Ｃｈｒｏｍａｔｉｎｈｉｇｈｅｒ－ｏｒｄｅｒｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓａｎｄｇｅｎｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＣｕｒｒＯｐｉｎＧｅｎｅｔＤｅｖ，２０１１，２１（２）：１７５－１８６．
［３］ＬｕｇｅｒＫ，ＤｅｃｈａｓｓａＭＬ，ＴｒｅｍｅｔｈｉｃｋＤＪ．Ｎｅｗｉｎｓｉｇｈｔｓｉｎｔｏｎｕｃｌｅｏｓｏｍｅａｎｄｃｈｒｏｍａｔｉｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅ：ａｎｏｒｄｅｒｅｄｓｔａｔｅｏｒａｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄａｆｆａｉｒ［Ｊ］．ＮａｔＲｅｖＭｏｌＣｅｌｌＢｉｏｌ，２０１２，１３（７）：４３６－４４７．
［４］ＫａｐｌａｎＮ，ＭｏｏｒｅＩＫ，Ｆｏｎｄｕｆｅ－ＭｉｔｔｅｎｄｏｒｆＹ，ｅｔａｌ．ＴｈｅＤＮＡ－ｅｎｃｏｄｅｄｎｕｃｌｅｏｓｏｍｅｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎｏｆａｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｇｅｎｏｍｅ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，２００９，４５８（７２３６）：３６２－３６６．
［５］ＬｉＧ，ＭａｒｇｕｅｒｏｎＲ，ＨｕＧ，ｅｔａｌ．Ｈｉｇｈｌｙｃｏｍｐａｃｔｅｄｃｈｒｏｍａｔｉｎｆｏｒｍｅｄｉｎｖｉｔｒｏｒｅｆｌｅｃｔｓｔｈｅｄｙｎａｍｉｃｓｏｆｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎｉｎｖｉｖｏ［Ｊ］．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｅｌｌ，２０１０，３８（１）：４１－５３．
［６］ＧｒａｃｅｙＬＥ，ＣｈｅｎＺＹ，ＭａｎｉａｒＪＭ，ｅｔａｌ．Ａｎｉｎｖｉｔｒｏ－ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｈｉｇｈ－ａｆｆｉｎｉｔｙｎｕｃｌｅｏｓｏｍｅ－ｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎｇｓｉｇｎａｌｉｓｃａｐａｂｌｅｏｆｔｒａｎｓｉｅｎｔｌｙｐｏｓｉ－ｔｉｏｎｉｎｇａｎｕｃｌｅｏｓｏｍｅｉｎｖｉｖｏ［Ｊ］．ＥｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓＣｈｒｏｍａｔｉｎ，２０１０，３（１）：１３．
［７］ＩｔｏＴ，ＢｕｌｇｅｒＭ，ＰａｚｉｎＭＪ，ｅｔａｌ．ＡＣＦ，ａｎＩＳＷＩ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇａｎｄＡＴＰ－ｕｔｉｌｉｚｉｎｇｃｈｒｏｍａｔｉｎａｓｓｅｍｂｌｙａｎｄｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇｆａｃｔｏｒ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ，１９９７，９０（１）：１４５－１５５．
［８］ＬｉＧ，ＭａｒｇｕｅｒｏｎＲ，ＨｕＧ，ｅｔａｌ．Ｈｉｇｈｌｙｃｏｍｐａｃｔｅｄｃｈｒｏｍａｔｉｎｆｏｒｍｅｄｉｎｖｉｔｒｏｒｅｆｌｅｃｔｓｔｈｅｄｙｎａｍｉｃｓｏｆｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎｉｎｖｉｖｏ［Ｊ］．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｅｌｌ，２０１０，３８，４１－５３．
