動物卵母細胞體外成熟 （IVM）、體外受精（IVF）、卵胞漿內單精子注射（ICSI）和克隆等技術是動物胚胎工程的主要研究內容之一。近年來，家畜卵母細胞的體外成熟培養技術得到進一步提高，不僅為家畜胚胎生物技術提供了大量卵源，同時也是研究卵母細胞發生和發育規律的有效手段,但仍存在卵母細胞的成熟率、卵裂率及其囊胚發育率低等問題。為解決這一難題，秦鵬春等進行了大量的研究工作，認為FSH和LH這兩種激素對豬卵母細胞IVM和排卵起到至關重要的作用.
SMAD3是TGF-β （transforming growth factor β）的下游受體激活蛋白。TGF-β超基因家族是在卵泡的生長、發育、閉鎖及卵細胞的成熟和甾體激素的產生等方面都有重要的作用.SMAD3是其下游信號傳導分子,TGF-β首先與TGF-βI（ITGF-βreceptor typeII）結合，迅速磷酸化TGF-βI（TGF-βreceptor typeI），繼而激活SMAD3使其磷酸化，并與SMAD4結合轉移入核，調節靶基因的功能.有大量實驗表明，TGF-β/Smads通路對卵泡的發育、顆粒細胞的增值有重要作用，其變化可影響內分泌激素的作用，從而影響卵巢的功能.
開發優良家畜的生殖潛能，直接為社會提供優質的生殖配子或胚胎，必將創造更大的經濟和社會價值。因此，本實以豬卵做研究對象，研究Smad3基因在豬卵母細胞成熟過程中的表達特征，為闡明Smad3基因與卵母細胞體外成熟的關系奠定基礎。
1 材料與方法
1.1 材料
豬卵巢來自青島市即墨屠宰場屠殺的青年母豬。采集卵巢后將其放入盛有青霉素、鏈霉素的37℃生理鹽水保溫瓶中，2 h內送回實驗室進行卵母細胞的收集。將分別培養到0、24、36 h和48 h的COCs進行透明質酸酶消化，去除卵母細胞周圍的顆粒細胞，Hoechst染色后在倒置顯微鏡下觀察各個不同時期的細胞形態。卵母細胞GV期時卵內有一個較大的核，位于近邊緣處，核膜清晰。GVBD期卵母細胞生發泡破裂，核膜消失，染色質凝集成團塊狀。MⅠ期卵母細胞染色體形成，并有規律的排列在赤道板上。MⅡ期卵母細胞最顯著的特征是排出第一極體。
卵母細胞周圍的卵丘細胞在結構上與卵母細胞相聯系，參與GSH的合成。已有研究證明，卵丘細胞對于牛、豬和倉鼠卵母細胞中GSH合成起重要作用。
GSH在MⅡ期卵母細胞中的濃度大約是GV期卵母細胞中的2倍。在受精卵和胚胎早期發育階段，GSH濃度迅速下降.GSH有還原型和氧化型（GSSG）2種形式。用分光光度計讀取不同濃度谷胱甘肽的分光光度值，做成如圖1的標準曲線?！緢D1】
1.2 方法
1.2.1 卵丘細胞-卵母細胞復合體的采集 對采集的卵巢用37℃的生理鹽水清洗3~4次，用18號針頭的20 mL的注射器，從直徑3~6 mm卵泡的中抽吸卵丘細胞-卵母細胞復合體（COC）。為了保護卵母細胞，抽吸前在注射器中吸取少量預熱的TCM199培養液。
抽完后將盛有COCs的50 mL離心管放置于38.5℃的水浴鍋中靜置以使COCs沉淀，每次靜置15~20 min,棄上清液，用TCM199進行清洗2~3次，慢慢進行吹打，防止卵母細胞周圍卵丘細胞脫落。將處理好的含有COCs的TCM199轉入培養皿中，將培養皿置于體視顯微鏡下，撿出有3層以上卵丘細胞的COCs.
1.2.2 卵丘細胞-卵母細胞復合體的體外培養 把清洗干凈的COCs用吸管轉移至提前做好的培養滴中（6 cm培養皿，每個液滴150 μL,38℃，5% CO2,飽和濕度的培養箱）進行培養，其上覆蓋礦物油。成熟培養液：TCM199培養液中添加L-半胱氨酸0.57 mmol/L、FSH 0.5 μg/mL、LH 0.5 μg/mL和 EGF 10 ng/mL.
培養0、24、36h和48h后，進行Hoechst染核（15min），在倒置顯微鏡下觀察GV、GVBD、MⅠ和MⅡ4個不同時期卵母細胞細胞核的形態，統計各個時期的比率，并進行分類收集。
1.2.3 卵母細胞核質成熟的評定 細胞質成熟主要檢測指標的是谷胱甘肽在4個不同時期（GV,GVBD、MⅠ和MⅡ）表達量的變化。用GSH檢測試劑盒對GSH進行檢測，按照Gasparrini等的方法，用紫外分光光度計測定豬卵母細胞內的GSH濃度。細胞核成熟檢測指標主要是統計卵母細胞在培養48 h后排出第一極體的比率。
1.2.4 卵母細胞不同成熟時期 Smad3 基因 mRNA 的表達檢測 將抽取的COCs,分別培養到0、24、36、48 h后消化分離卵母細胞和卵丘細胞，分別鑒定收集GV、GVBD、MⅠ和MⅡ的卵母細胞，利用單細胞RT-PCR技術檢測Smad3基因的相應時期的表達情況。RT反應體系：5× RT Buffer,4 μL;Enzyme Mix,1 μL;047A primerMix,1 μL;RNase Free 雙蒸水，4 μL. RT 反應條件：25℃，10 min;37℃，15 min;85℃，5 s;4℃，∞。實驗采用β-actin 作為內參基因。擴增Smad3基因的引物序列如表 1. 反 應 體 系 為 cDNA,2 μL;SYBR Premix ExTaqTM（2×），12.5 μL;RNase-free water,9.5 μL;Forwardprimer,1 μL （5 μmol/L）；Reverse primer,1 μL （5 μmol/L）；共計20 μL.反應條件：95℃ 10 min;95℃ 15 s,60℃1 min,72℃ 10 s,循環40次。所用的數據均進行了中值標準化，平均數和標準差來源于3 個重復測量的結果，并且樣品基因的相對表達量均進行了繪圖。每個試驗均重復3 次。計算公式為2^-（Cp目的基因-Cp內參基因）?！颈?】
1.2.5 卵母細胞不同成熟時期 SMAD3 蛋白磷酸化水平檢測 利用Western blot檢測體外減數分裂成熟不同時期磷酸化Smad3的表達量，將COCs在體外培養0、24、36、48 h后，收集卵母細胞并Hoechst染核后，分別鑒定收集GV、GVBD、MⅠ和MⅡ的卵母細胞，用PIPA 裂解液和 SDS -PAGE 蛋白上樣緩沖液處理，在冰上處理30 min,處理過程中每隔10 min,懸浮震蕩1~2 min,裂解后，再加入4 μL SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液，沸水處理5 min,未進行實驗的樣品可以置-20℃ 保存。實驗中用到的一抗為Rabbit mab（按1∶200稀釋），二抗為辣根過氧化物標記的山羊抗兔IgG（按1∶1000稀釋）。
1.3 統計分析
卵母細胞GV、GVBD、MⅠ和MⅡ各時期的比例用ANOVA 方法分析。來自AVOVA 的重要結果再用Tukey 分析。Western Blot 結果圖片掃描后，利用IPWIN 60進行灰度分析。40× 鏡下進行各級卵母細胞計數，并將其比例利用SAS 軟件進行方差分析。將Smad3基因的定量PCR 結果和GSH表達量測定結果利用SAS 軟件進行方差分析.對所有的分析結果P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著，每次實驗至少重復3 次。
2 結 果
2.1 卵母細胞到達不同時期的比率 統計卵母細胞到達GV、GVBD、MⅠ和MⅡ4個不同時期的比率。如表2所示?！颈?】
2.2 卵母細胞細胞質成熟-GSH的測定 根據圖1標準曲線，計算出GV、GVBD、MⅠ和MⅡ4個不同時期GSH的濃度。在本實驗中，培養的卵母細胞的谷胱甘肽水平隨著培養時間的延長有所增高。說明在培養過程中卵母細胞細胞質成熟水平提高了。但是還不能達到體內GSH的水平，說明體外培養的環境還需要進一步提高。如圖2、3所示，GVBD、MⅠ期與GV期相比差異顯著（P<0.05）。MⅡ期時，GSH水平達到峰值，與GV期相比差異極顯著（P<0.01）?！緢D2】
2.3 Smad3基因在卵母細胞不同成熟時期的表達情況 本實驗旨在檢測Smad3基因在卵母細胞發育過程中的表達情況，如圖4所示，在卵母細胞成熟過程中的0、24、36 h和48 h,在倒置顯微鏡下撿取GV、GVBD、M Ⅰ 和 M Ⅱ 4 個不同時期的卵母細胞，通過單細胞RT-PCR檢測，Smad3基因表達量隨著卵母細胞的不同成熟階段逐漸上升。GVBD和MⅠ期的mRNA水平與GV期相比，差異顯著（P<0.05）。M Ⅱ 期 mRNA 水平達到峰值，與 GV 期相比，差異極顯著（P<0.01）?！緢D3.圖4】
2.4 SMAD3蛋白在卵母細胞不同成熟時期的磷酸化水平 為進一步研究SMAD3信號通路在卵母細胞不同成熟時期的發育過程是否發揮作用，體外培養0、24、36 h 和 48 h 后，在倒置顯微鏡下撿取 GV、GVBD、MⅠ和MⅡ4個不同時期的卵母細胞，在蛋白水平上進行檢測，結果如圖5所示，隨著培養時間的延長，P-SMAD3蛋白的表達水平是逐漸升高的，表明卵母細胞減數分裂成熟可能與Smad3基因的表達有關?！緢D5】
3 討 論
3.1 影響
豬COCs體外發育的因素 影響豬COCs體外發育的因素眾多，在實驗過程中發現，保存卵巢生理鹽水的溫度是影響哺乳動物卵母細胞體外成熟的影響因素之一，對卵母細胞的成熟起了重要的作用。
有關采集卵巢所用生理鹽水溫度的研究很多，從20℃、25℃、30℃、31℃一直到37℃、39℃均有研究.刑風英等報道，在22℃、30℃、37℃、38.5℃、40℃下保存卵巢，隨著保存溫度不斷升高，卵母細胞的體外成熟、卵裂率和囊胚率明顯下降，37℃的生理鹽水保存豬卵巢的效果最好。Prather等也曾報道了25℃和39℃的生理鹽水溫度對卵母細胞發育潛力有影響。
在取卵時，應先在水浴鍋內預熱生理鹽水達到所需溫度，本試驗在37℃生理鹽水中保存豬卵巢，2 h內將卵巢運回實驗室。但是由于屠宰場到達實驗室的路程較遠，再加上氣溫等外界諸多條件的影響，卵巢在到達實驗室時，溫度大約降低4~5℃，因此，取卵時生理鹽水的溫度要根據天氣變化做適當的調整，預防溫度過低，影響卵母細胞體外成熟效果。激素對豬卵母細胞的體外成熟起著關鍵的作用。在體內環境中，卵母細胞在內源激素的作用下逐漸生長、發育、成熟，最后在LH峰的作用下排出體外，FSH與卵丘的擴張和卵母細胞質成熟有關。激素在豬卵母細胞體外成熟的影響中，發現豬在無激素的存在時也趨于發生減數分裂恢復，但培養液中加入FSH和LH,會明顯加速減數分裂，而且LH可促進細胞質成熟.
卵母細胞和顆粒細胞共培養的條件下，細胞有很好的生長發育情況，在裸卵的情況下，卵母細胞的生長出現停滯不前的狀態。結果說明，顆粒細胞對卵母細胞的發育有至關重要的作用。它可以提供卵母細胞的發育所需要的各種營養物質，所以顆粒細胞在卵泡發育的早期起著支持細胞的作用。在體外成熟過程中，卵丘細胞和卵母細胞存在著一定的相互作用，兩者之間有間隙連接，可以相互傳遞營養物質和信息，從而進一步促進卵母細胞的成熟。所以說，抽取完整的健康的卵丘細胞對卵母細胞體外成熟有至關重要的作用。有研究發現，在豬的卵母細胞體外成熟過程中，在不存在卵丘細胞的情況下，向培養液中添加一定量的谷氨酰胺，即使能夠促進GSH的含量，但是能夠阻滯胚胎發育。因此有學者認為，卵丘細胞的擴散可以作為卵母細胞體外成熟的判斷標準之一。
3.2 卵母細胞成熟中 GSH 和半胱氨酸的作用
卵子的成熟包括核的成熟和細胞質的成熟。如果細胞質成熟不充分，那么卵胞質中就會缺少使魚精蛋白二硫鍵分解和染色質解聚的因子，包括谷胱甘肽（GSH）、核質因子（nucleoplasmin）和細胞成熟促進因子（MPF）等，精子進入后，精核解聚受阻造成受精失敗。因為核成熟進程影響細胞質成熟，而細胞質成熟對細胞核成熟又具有促進作用。體外核成熟的完成并不能保證細胞質的正常成熟，細胞核和細胞質的成熟具有協調性。所以檢測卵母細胞中GSH的含量代表了細胞質的成熟狀態。GSH在哺乳動物細胞中發揮著重要的生物學作用，參與卵母細胞的成熟.半胱氨酸是GSH的前體物質，在牛卵母細胞IVM時，疏基復合物能增加細胞內的GSH的濃度，并保持GSH高濃度狀態，從而提高胚胎的發育率.
在豬卵母細胞成熟過程中，培養24 h和36 h時，卵母細胞內GSH的濃度差異是不顯著，而在48 h時，相對于GV期，GSH的濃度顯著增高，當卵母細胞進入MⅡ期時，GSH濃度達到最高峰。有研究證實，高濃度的半胱氨酸在成熟培養全過程中能顯著影響囊胚的發育，用含半胱氨酸的培養液培養豬的卵母細胞，可提高豬卵母細胞的成熟率.細胞內GSH的濃度較低可能是卵母細胞發育能力較低的原因。確切地說，GSH是卵母細胞活性和發育能力的生化標志物。
3.3 SMAD3 對卵母細胞發育的影響
SMAD3 在發情前期、發情期、發情后期以及乏情期的大鼠卵巢均有表達，定位于原始和初級卵泡的卵母細胞，腔前卵泡和小有腔卵泡期定位于顆粒細胞，大有腔卵泡中表達變少。Smad3在TGF-β抑制T細胞的活化及增殖功能方面發揮重要作用.Wolfraim等研究急性T細胞性白血病患兒體內Smad3基因的表達情況，結果發現雖然Smad3 mRNA表達水平正常，但是患兒體內檢測不到SMAD3蛋白質，研究證實，TGF-β對白血病患者淋巴細胞增殖的抑制作用是Smad3途徑依賴的。Smad3屬于受體激活的Smads,它主要轉導TGF-β和活動素的信號。Smad3基因剔除研究部分闡明了Smad3基因在脊椎動物發育中的功能。有實驗表明，在Smad3基因缺失的小鼠體內卵泡發育紊亂，竇前卵泡向竇卵泡的發育受阻，凋亡基因的表達改變，顆粒細胞凋亡增加，閉鎖卵泡顯著增加.還有研究顯示，Smad3基因缺失的雌性小鼠缺乏正常的動情周期，不能正常排卵；體外培養Smad3基因缺失的小鼠竇前期卵泡對FSH的刺激反應極為有限，卵泡中顆粒細胞數量很少，卵巢和顆粒細胞中CyclinD2等基因的表達明顯減少，FSH不能刺激其卵泡的早期發育。另有研究發現，表皮生長因子促進卵巢顆粒細胞的增值需要SMAD3的存在.研究結果表明，Smad3 基因mRNA 水平隨著卵母細胞的發育表達量逐漸升高，在到達MⅡ期時，Smad3基因mRNA水平最高，與GV期mRNA水平相比差異極顯著（P<0.01）。這表明卵母細胞體外發育過程中Smad3基因起著非常重要的作用。同時SMAD3蛋白的磷酸化水平也是隨著培養時間的延長表達量是上升的趨勢，但是本實驗并未對SMAD3抑制劑等做相關的研究與探討，只能說明卵母細胞不同成熟時期的發育可能是通過SMAD3通路發揮作用。
SMAD3在卵母細胞減數分裂成熟中的表達以及磷酸化變化是逐漸上升的，該基因在IVM過程中，促進細胞的減數分裂。為最終完善卵母細胞成熟的分子調控機制，實現對卵泡卵母細胞發育的精確調控，開發優良家畜的生殖潛能，促進優良家畜品種的培育奠定了基礎。
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