蘭尼定受體（ Ryanodine Receptors）在肌肉收縮中起關鍵作用。蘭尼定受體是細胞內質網膜上介導細胞內鈣信號轉導的離子通道.蘭尼定受體是由分子量為560 kDa 的相同亞單位組成的四聚體，整個蛋白質的分子量超過 2000 kDa,是目前已知最大的膜蛋白。
蘭尼定受體基因的突變可以導致人和動物的一些病癥，例如惡性高熱癥（ Malignant Hyperthermia）.人類的骨骼肌型蘭尼定受體基因（ RYR1） 中已經發現 22 個能導致惡性高熱癥的突變.豬的惡性高熱癥（ 又稱為豬應激綜合癥） 表現為豬受到應激刺激出現肌肉緊張、呼吸促迫、心跳加快，體溫升高，嚴重者可致突然死亡。這種豬宰后會產生肉色蒼白、質地松軟、切面滲出的劣質肉.研究證實，豬對惡性高熱癥的易感性是由于主要原因是骨髂肌型蘭尼定受體（ RYR1） 基因的突變導致的。豬 RYR1 基因的 1843 堿基處發生的 C→T 堿基突變，使蘭尼定受體由第 615 位的精氨酸變為半胱氨酸，從而導致結構和功能的改變。這樣使應激狀態下 Ca2 +大量釋放，引起電解質代謝紊亂，肌肉持續收縮，同時引起肌肉 pH 值異常變化，導致豬由正常的應激抵抗轉變為對應激敏感，進而引發了繁殖、生長、胴體和肉質性狀等發生全方位的變化.因此，在豬的選育工作中，已經廣泛應用蘭尼定受體基因作為篩選良種的指標之一。
目前許多脊椎動物的蘭尼定受體基因已經被克隆,無脊椎動物如果蠅、線蟲和海膽等的蘭尼定受體基因也已經被克隆。近期筆者課題組克隆了凡納濱對蝦（ Litopenaeus vannamei） 的蘭尼定受體基因.本研究旨在查找凡納濱對蝦蘭尼定受體基因的 SNP 位點，并進行 SNP 與對溫度變化敏感性的關聯分析，結果有助于了解對蝦應激易感性的分子機制。
1 實驗材料與方法
實驗選用無特定病原（ SPF） 凡納濱對蝦的平均體重大約為 3 g,來自廣西水產研究所良種場。
1. 1 溫度變化刺激試驗 凡納濱對蝦共 192 尾，暫養于塑料桶的海水中，水溫 25 ℃。養殖 24 h 后，迅速轉入 38 ℃水溫的塑料桶中，觀察對蝦的行為反應。出現痙攣現象的對蝦歸入應激敏感組，不出現痙攣現象的對蝦歸入應激抵抗組。隨后，用 DNA 提取試劑盒（ 天根生物技術公司） 提取各對蝦的基因組 DNA.
1. 2 單核苷酸多態性（ SNP） 位點的查找及基因頻率分析 根據筆者前期獲得的凡納濱對蝦蘭尼定受體基因序列（ Genbank: HM367069） ,使用 Primer Premier 5.0軟件設計 1 對引物： 5' - ATCATTGTTGCTGTTATTGT-TATTAT - 3'; 5' - TCTTCTTCGTCTTCACTGAGGTACTT- 3',預計擴增 538 bp 基因片段。PCR 反應體系包含50 ng 基因組 DNA,12. 5 μL Taq Master Mix（ 天根生物技術公司） ,1 μL 正向引物（ 濃度 10 μmol/L） ,1 μL 反向引物（ 濃度 10 μmol/L） ,補充無菌純水至 25 μL.反應條件為： 先 94 ℃變性3 min; 然后94 ℃ 30 s,60 ℃ 30s,72 ℃ 30 s,共 35 個循環； 最后 72 ℃ 延伸 10 min.隨機取 24 個對蝦樣品基因組 DNA 進行 PCR 擴增，擴增產物經膠回收純化后，進行雙向測序（ 由天根生物技術公司完成） ,用 DNAMan 軟件比對測序結果，查找 SNP位點。發現 SNP 后，用同樣的引物對 192 尾凡納濱對蝦基因組 DNA 進行 PCR 擴增，然后進行單向測序，根據測序圖譜判斷 SNP 位點的基因型，統計各組基因型頻率以及等位基因頻率，然后用卡方檢驗其是否符合哈迪 - 溫伯格平衡定律（ Hardy - Weinberg Equilibri-um,HWE） .用 SPSS 13. 0 軟件對各組對蝦的基因型頻率和等位基因頻率進行單因素方差（ ONE - WAYANOVA） 分析.
2 結果與分析
2. 1 溫度變化刺激試驗 試驗觀察到，當凡納濱對蝦從 25 ℃海水中被迅速轉移到 38 ℃ 海水中后，所有的凡納濱對蝦都快速游動、腹部收縮、彈跳和身體失去平衡。18 尾凡納濱對蝦被觀察到不可逆轉的尾痙攣并且很快死亡（ 圖 1 - B） ,被歸入應激敏感組。而其余的凡納濱對蝦（ 174 尾） 尾痙攣癥狀較溫和并且可以恢復正常（ 圖 1 - A） ,被歸入應激抵抗組。隨后，分別提取所有的凡納濱對蝦基因組 DNA 用來檢查 SNP 及其基因型。
2. 2 SNP 檢測及基因頻率分析 首先對隨機抽取的24 個對蝦樣品進行 PCR 擴增蘭尼定受體基因片段，擴增產物純化后直接進行雙向測序，用 DNAMan 軟件比對測序結果，結果發現了 1 個 C/G SNP（ 圖 2） ,位于第409 堿基的位置，是 Leu→Leu 同義突變。隨后，同樣用直接單向測序的方法對 192 尾凡納濱對蝦進行 SNP 基因型的檢測。用 Chromas 軟件查看測序圖譜，根據圖譜人工判斷基因型，單峰為純合基因型，套峰為雜合基因型（ 圖 2） ,統計計算應激敏感組和應激抵抗組的基因型頻率和等位基因頻率（ 表 1） .卡方檢驗結果表明應激敏感組和應激抵抗組的基因型頻率分布都符合哈迪 - 溫伯格平衡定律。對應激敏感組和應激抵抗組對蝦基因型頻率單因素方差分析結果 P =0. 004,等位基因頻率單因素方差分析結果 P =0. 007,說明兩組間的基因型頻率及等位基因頻率差異顯著?！緢D1.圖2】
3 討論
凡納濱對蝦是世界最重要的對蝦養殖品種之一.以往凡納濱對蝦的研究主要集中在生物學和生態學方面。近年來，越來越多的學者對凡納濱對蝦進行分子生物學方面的研究.和其它動物一樣，對蝦受到物理或化學因子的刺激會產生應激反應。例如，當環境溫度劇烈變化時，對蝦會產生應激反應，應激敏感的對蝦全身或局部收縮，尾部彎曲后大部分不能自由伸展，腹肌白濁，甚至會死亡.此外，高溫、強光、過度擁擠、捕撈、換水、受驚嚇等外部條件刺激等也常常會引起對蝦的應激反應.但是，通常產生應激反應的對蝦只占一部分比例，而另一部分對蝦不會出現應激反應，其原因目前還沒有研究報道。
為了研究對蝦應激反應易感性與蘭尼定受體基因的相關性，筆者首先在凡納濱對蝦的蘭尼定受體基因片段中查找 SNP 位點。PCR 產物直接測序是檢測未知 SNP常用的方法，具有方便、快捷和準確等優點.隨著測序成本的降低，直接測序法也經常用于已知 SNP 的基因型檢測。
本研究在凡納濱對蝦蘭尼定受體基因序列中發現了 1 個 SNP 位點，是外顯子中的同義突變，它沒有改變編碼的氨基酸，沒有對蘭尼定受體的生理功能直接產生影響，但是由于它和蘭尼定受體基因可能存在的錯義突變位點在染色體上距離很近，通常會連鎖遺傳，因此可以作為連鎖標記進行性狀關聯分析。如果將來的研究發現更多的 SNP 位點，用多個 SNP 的單倍型進行連鎖分析則結果更加穩定、可靠。當然，最好是能找到直接影響應激敏感性狀的錯義突變位點。然后，筆者進行了凡納濱對蝦的溫度變化刺激試驗，觀察對蝦的應激反應。比較分析應激敏感組和應激抵抗組對蝦的SNP 頻率分布，結果表明： 應激敏感組和應激抵抗組基因型及等位基因頻率分布差異顯著（ P <0.01） ,說明試驗對蝦的應激敏感性與蘭尼定受體基因的多態性相關。因此可以推測，應激敏感的對蝦蘭尼定受體基因中可能存在改變氨基酸序列的錯義突變點而導致對應激的敏感性，這有待于將來在全長蘭尼定受體基因序列中查找突變點和進行更多的應激試驗和關聯分析來證實?！颈?】
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