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第一章 緒 論

1.1 黃瓜白粉病及其抗性基因定位研究概況

黃瓜（Cucumis sativu. L.）是我國主要的蔬菜作物，是面積最大的保護地栽培蔬菜之一。黃瓜白粉病是一種為害嚴重的世界性病害（馮東昕 等，1996；Block et al，2005），在生產上，白粉病與霜霉病、枯萎病并稱為黃瓜三大病害。白粉病在我國各地均有發生，且常發生在結瓜盛期，導致葉片光合能力下降或者喪失，嚴重影響果實的品質和產量。

為了應對白粉病的發生，研究者對黃瓜白粉病的發病規律和抗性基因的定位方面進行了大量的研究，取得了一系列進展，特別是隨著國際黃瓜基因組計劃的開展（張圣平 等，2010），黃瓜全基因組測序的完成，開發了大量的新型分子標記（SSR，InDel 等），大大促進了白粉病抗性基因的研究工作，但即使如此仍然沒有得到一致的結論（劉苗苗 等，2009）。這主要是由以下三個因素導致的：首先，研究材料的差異，不同的研究材料帶有的抗性基因不同，抗性機制也可能不同，抗性的程度也有差異，導致不同的學者研究結果分歧很大；其次，白粉病的發生和發展受周圍環境（如溫度、濕度等）影響較大，難以保證抗病性鑒定的發病條件完全一致；第三，目前對白粉病抗性的鑒定主要是通過研究者肉眼觀察發病情況，對其抗性進行評價，而不同的研究者的評價標準具有很大的主觀因素干擾。

1.1.1 黃瓜白粉菌簡介

白粉病的病原菌是真菌白粉菌科，菌絲全部或大部分暴露在寄主植物的莖、葉和果實等表面，產生大量的菌絲體和分生孢子等白色粉狀物，故而得名，白粉病在全世界范圍內廣泛分布。由于白粉病的巨大危害，世界瓜類生產國都將白粉病抗性育種列為主要育種目標之一（劉秀波 等，2005）白粉菌寄主范圍因病原菌種類不同而異，但是一般的來說，一種植物只發生一種白粉病，但也有例外。黃瓜白粉病原菌主要有兩個屬：單囊殼白粉菌 Podosphaera xanthi（i異名（Sphaerothecafuliginea））和二孢白粉菌 Golorinomyces cichoracearum（異名 Erysiphe cichoracea rum）（張素勤 等，2007；劉龍洲 等，2008），在中國主要是前者（Xu et al.，1999；王建設 等，2003；張艷菊 等，2010）。該病原菌寄主范圍主要集中在黃瓜、西甜瓜、南瓜等葫蘆科作物，并有多種生理小種（曲麗 等，2007）。白粉菌孢子在 15-30℃下均可萌發，以 20-25℃最適。對濕度要求更廣，最低在相對濕度 25%下也可以萌發，但是在過高的濕度下容易吸水破裂，45~75%時發病快，超過 95%受到抑制。在做白粉病抗性的人工鑒定時，一定要注意保持白粉病發病的適合條件才能得到準確的結果。

1.1.2 黃瓜白粉病抗病性鑒定方法

對于作物的基因定位研究而言，表型鑒定是至關重要的一個環節，而抗病基因的定位研究就需要對作物的抗病性進行客觀的、準確的、穩定的評價。影響黃瓜白粉病發生和發展的因素很多，不同的接種方法、環境條件的控制都會直接影響鑒定的結果。為了使不同的研究人員的結果具有可比性和比較好的重復性，有必要對抗病性鑒定的方法進行一些科學的規范。下面介紹一下本實驗采用的抗病性鑒定方法（參考中華人民共和國農業行業標準 NY/T 1857.2-2010 第 2 部分：黃瓜白粉病鑒定技術規程）。

1.1.2.1 苗期孢子懸浮液噴霧接種鑒定技術

該技術是指在植株苗期時，從已發病葉片上刷取白粉菌孢子到清水中，加入 SDS 后高速攪拌10min，配置成孢子懸浮液，然后將懸浮液均勻的噴灑到待鑒定植株葉片上。白粉病苗期孢子懸浮液噴霧接種鑒定比其他的接種鑒定方法具有非常明顯的優勢：實驗用地少、周期短、方便操作，大大減少了外界環境的影響的同時，一季度可以同時進行多次重復鑒定，加速鑒定進程和可靠性。多數研究者選用此方法（如張圣平 等 2011；劉龍洲 等 2008）。

黃瓜白粉病苗期抗性與成株期抗性的關系的相關報道不多，但是有多位學者對黃瓜霜霉病的苗期抗性與成株期抗性進行過研究報道，Jenkins（1946）對黃瓜霜霉病的抗性做了田間和室內的對比，認為苗期抗性與與成株期抗性表現一致。1994 年，我國學者許啟新對 9 種材料進行了研究，發現其苗期接種和成株期自然發病情況的相關性達到極顯著水平。黃瓜霜霉病和白粉病一樣都是真菌性病害，且已有研究表明黃瓜的白粉病抗性與霜霉病抗性具有顯著相關性（Van Vliet et al.，1977；丁國華 等，2004）1.1.2.2 田間成株期抗病性鑒定技術。田間成株期鑒定是指在病圃中正常栽培管理植株，讓其自然發病，待其充分發病后進行病情的調查。這種方法的前提是種植的病圃需要在往年連續發病，可為鑒定提供充足的侵染源，也有多位學者采用這種鑒定方法（如張素勤 等，2005；程嘉琪 等，2011）。田間成株期充分發病后的調查方法不同于苗期接種鑒定，因為發病時底部的葉片或已衰老脫落，不能反應其真實抗性，所以一般調查從下往上第 3~8 片真葉的病級的平均數作為這一株的病級，然后計算病情指數。這樣鑒定的結果更接近于自然發病，更符合生產上的環境和條件，能更好的說明其在實際生產中的抗性。

1.1.2.2 葉盤接種鑒定

所謂葉盤法就是用特定大小的圓形模具在黃瓜真葉上截取相同大小的圓盤，放在保濕的培養箱中，維持葉片正常的生理狀態，然后進行懸浮液噴霧接種，讓其在離體的情況下發病。發病后調查病斑面積，以其占圓盤面積的比例作為其發病情況的依據（Fukino et al., 2013）。這種方法的優點是節省空間，省時省力，容易控制環境因素的影響。缺點是截取葉片時會對葉片造成一定程度的損傷，破壞葉片原有的代謝方式，可能會改變很多酶的代謝活性或者表達量，而這些變化很有可能直接影響病原菌的入侵，進而影響鑒定結果；同時由于傷口的存在，葉片容易受到環境中細菌的感染，使葉片腐爛，影響白粉病斑的擴展和觀察，也會影響抗病性鑒定結果。

1.1.3 黃瓜白粉病發病規律及防治方法

黃瓜白粉病在植株全部發育階段均可發病，一般是中后期較重，主要侵染葉片，影響葉片的光合功能，甚至喪失光合能力，莖部和果實也可發病，但一般較輕。發病過程如下：初期產生白色斑點，環境條件適宜時向四周擴展至連成片，最后整個葉片布滿白色霉層。病害一般是從下往上侵染，發病后期，葉片枯黃，壞死，加速植株衰老（沈麗平 等，2009）。

防治白粉病的措施有很多，如加強田間管理、對溫室進行消毒處理等，但在生產上，防治白粉病主要依靠農藥防治（周益林 等．2001），為了達到較好的防治效果，一般需要過量用藥，增加了生產成本的同時也對環境造成巨大污染。所以培育抗白粉病新品種是防治白粉病最經濟最有效的手段。為了培育抗病新品種，研究人員對黃瓜白粉病抗性的遺傳規律、與抗性基因連鎖的分子標記開發、抗病基因定位等方面進行了大量的研究。

1.1.4 抗性遺傳規律研究

前人已有多篇關于黃瓜白粉病抗病遺傳規律的報道，但是不同學者研究的結果差異很大，尚不統一，總結現有報道可歸納為以下 4 種觀點：

（1）隱性多基因控制的數量性狀：1948 年，P. G. Smith 利用抗性材料 Puerto Rico 37 與感病材料雜交，發現 F1趨向于感病，在后代 F2中的抗感比為 1：21，認為 Puerto Rico 37 中的白粉病抗性是由多個隱性基因控制。1956年，Barnes 等以抗病材料 PI197087 為研究材料，通過構建遺傳群體進行遺傳分析，認為該抗性材料中含有一或兩個主效基因和一或兩個微效基因功能控制。1995 年，呂淑珍等通過研究認為黃瓜中最少 3 個以上的基因其對白粉病的抗性，并且感病表現為顯性性狀，具有較高的遺傳力。

Kooistra\\(1968\\)用三個親本構建兩個遺傳群體，分別進行配合實驗，得出黃瓜對白粉病的抗性在兩份不同的抗病材料中分別受到不同基因的控制：Natsufushinari 中含有 2 個抗病基因而 PI2008151 中只含有 1 個隱性的抗病基因，這三個基因均不相同，在 F2后代中表現出超親現象。張素勤（2005）用三個抗感雜交組合進行遺傳研究，認為有 2 個主基因控制黃瓜白粉病抗性，并且遺傳率均很高。

（2）隱性單基因控制：騰枝國光（1962）認為“青節成”中存在一個隱性的抗病基因。用這種抗病材料與感病材料雜交，F1均表現為感病，F2中抗感分離比為 1：3，依此得出其抗性有一個隱性的單基因控制。張桂華（2004）也通過構建遺傳分離群體進行遺傳研究，得到了與其相同的結論。劉龍洲（2008）用一對抗感親本構建遺傳群體，進行了苗期接種鑒定，結果后代分離群體（F2、BCR 和 BCS 群體）中分離比的結果完全符合孟德爾遺傳規律（P≤0.05）。由此得出結論，在抗病親本中由 1 個隱性基因控制其抗性，感病性狀為不完全顯性。

（3）由一對不完全隱性基因和 2 對上位修飾基因控制，Shanmugasundaram 等（1971，1972）用對白粉病具有完全抗性的黃瓜種質材料 P1212233、P123514 分別與感病親本進行雜交，發現 F1均表現為感病，F2群體中表現為抗性性狀分離，并且高抗、中抗、感病的單株數之比符合 1：3：12，根據孟德爾遺傳分離定律，認為其抗性是由一個隱性主基因 s，一個顯性基因 R 和一個顯性抑制基因 I 控制。這三個基因各自特點如下：s 是主效基因，決定下胚軸抗性,同時也是葉片抗性所必需的；R 基因主要影響葉片的抗性，I 基因為抑制基因，可使植物表現出不完全抗性，但對 s 基因的表達不產生影響。隨后，毛愛軍等（2005）、簡德明（2007）、王振國（2007）等分別以 WI 2757（高抗白粉病，美國陸地黃瓜自交系）與我國一份栽培品種進行雜交配置 F2為材料進行遺傳分析，研究結果與 Shanmugasundaram 基本一致。

（4）由一對隱性基因和一對不完全顯性基因控制，與溫度有關Morishita 等（2003）發現黃瓜的白粉病抗性由一對隱性基因和一對不完全顯性基因控制，并且抗性受到溫度的調節。根據其抗性對不同溫度條件的反應不同，將黃瓜材料分成三種類型：高溫（26℃）和低溫（20℃）下均表現為抗性的品種，如 PI197088-5\\(P\\)等，在高溫和低溫下均表現為感病的品種，如 Sharp（S），第三類就是只在高溫下才表現出抗性的品種，如 Natsufushinar（iN）。

用這三種類型的黃瓜進行互相雜交、自交和回交，并分別進行抗病性鑒定，結果表明：有兩個基因控制黃瓜的抗白粉病性狀 aa 和 BB。只有 aaBB 這種基因型時，黃瓜才能在高溫和低溫下均表現出抗性，且為完全抗性；當為 A_bb 時，黃瓜在高溫和低溫下均表現出感??；當為 aaB_時，黃瓜會表現出高溫下抗病而低溫下感病。

可以看出，黃瓜的白粉病抗性機制復雜，黃瓜白粉病的抗性規律研究很多而雜，尚未得出統一結論，這嚴重影響下一步白粉病抗性基因的進一步精細定位和克隆。一般認為主要由以下幾個因素造成：首先黃瓜白粉病病原菌具有不同生理小種，不同的研究所用的病原菌有差異;其次，不同研究者進行抗病性鑒定采用的鑒定方法不統一，如接種時機、環境條件控制、病情調查時間等，并且多為肉眼觀測，易引入主觀誤差，不同的抗病材料所含有的抗病基因可能不同，抗病機制復雜。所以，不同學者的研究結果千差萬別。

1.1.5 抗性分子標記與遺傳定位的研究

在黃瓜的抗白粉病育種工作中，對材料的抗病性鑒定是影響育種進程最重要的因素，影響白粉病的田間鑒定的環境條件較多，費時費力，一些學者就試圖通過尋找與抗病基因連鎖的分子標記來進行分子輔助選擇育種\\(MAB\\),從而提高育種效率。

張桂華（2004）利用 F2分離群體，結合 BSA 建池法構建抗感池，得到一個 AFLP 標記，并成功轉化成 SCAR 標記，連鎖距離為 5.56cM。隨后，多位學者也陸續得到了多個與黃瓜白粉病抗性相關基因連鎖的分子標記（張素勤 等，2005；簡德明 等，2007；王振國 等，2007；張海英 等，2006）。這些分子標記一般都是 AFLP 或 SCAR 標記，穩定性較差且遺傳距離相對較遠。

張海英\\(2008\\)采用 SSR 分子標記技術，獲得兩個與黃瓜抗白粉病基因連鎖的 SSR 標記，遺傳距離最近達到了 5cM。聶京濤（2011）利用 BSA 建池法獲得一個與白粉病抗病基因連鎖的 SSR 分子標記 SSR15592，遺傳距離為 7.62cM。隨著分子生物學的發展，以及黃瓜抗病育種的需求，對白粉病抗性基因的定位研究也愈加深入，特別是 QTL 分析方面，取得了非常不錯的成果：Sakata（2006）利用高抗材料 PI197088-1 和高感材料 Santou 作為親本，構建了重組自交系（RILs）群體，共檢測到 5 個與抗白粉病有關的 QTL，其中只有一個位點在高溫（26℃）、低溫（20℃）下對抗性均起作用，其他的僅在高溫或者低溫下起作用。這是第一次對不同溫度條件下的抗病基因進行分別 QTL 定位。

劉龍洲（2008）利用黃瓜抗病自交系 S06 與感病自交系 S94 配置群體，構建了一個 F6：7重組自交系，分別與 2005 年秋和 2006 年春兩個季度進行了苗期噴霧接種抗病性鑒定和 QTL 定位分析，認為白粉病抗性屬于數量遺傳，并且鑒定出至少四個 QTL 位點調控其抗性。這四個 QTL 位點分別命名為 pm1.1, pm2.1, pm4.1 和 pm6.1，其中 pm1.1、pm2.1、pm4.1 在兩次實驗中均被檢測到。兩季度檢測到的 QTL 的表型解釋率合計分別達到了 52.0%和 42.0%。檢測到的位點較多，表型解釋率也較高，但是，這些位點卻沒能與染色體對應。

張圣平（2011）利用從國內栽培品種中篩選出來的高抗和感病自交系作為親本，構建遺傳分離群體，進行遺傳和 QTL 定位分析，認為其 F2后代群體中抗病性呈連續分布，符合數量性狀遺傳特征，最終檢測到 4 個 QTL 位點（pm5.1、pm5.2、pm5.3、pm6.1），分別位于黃瓜 5 號和 6 號染色體上，其中，除了 pm6.1 之外，其余三個位點均被重復檢測到，特別的 pm5.2 的表型解釋率最高，在兩次實驗中分別達到了 36.1%和 41.6%，對應的 LOD 值分別達到了 15.06 和 17.88，檢測到多個有價值的 QTL 位點，并且與染色體物理位置對應，具很高的應用價值。Fukino（2013）同樣利用高代重組自交系進行了白粉病的 QTL 定位，用不同的鑒定方法，在不同的季度，不同的溫度下進行了抗病性鑒定，檢測到多個 QTL 位點，其中被重復檢測到的表型解釋率較高的 QTL 位點有：pm1.2、pm5.2、pm5.3、pm6.1，其中 pm1.2 和 pm6.1 在四次實驗中均被檢測到，pm5.3 被檢測到三次。

He 等（2013）利用 F2群體，在不同季度下對子葉、下胚軸、真葉分別進行抗病性調查，并進行了 QTL 分析，并對前人的研究成果進行了詳細的整合。發現除了黃瓜 2 號染色體上之外，其余的六條染色體均被檢測到 QTL 存在。其中檢測到次數最多的位點位于黃瓜 5 號染色體（Chr5）上。并且發現黃瓜下胚軸的白粉病抗性是由單基因控制，并且定位于 5 號染色體上。

綜上所述，黃瓜白粉病抗性遺傳機制復雜，檢測到的相關基因較多，不同抗病材料所具有的抗病基因不同，并且分布在不同的染色體上。目前研究的結果主要集中在黃瓜 5 號染色體上，而其他染色體上的抗病基因研究較少，完成全基因組范圍的白粉病抗性基因的挖掘將有利于綜合利用黃瓜種質中的抗性資源。

1.2 黃瓜白粉病抗病基因挖掘的研究

1.2.1 植物病原互作模式的研究進展

在自然界中，充滿了各種病原菌，包括真菌、細菌和病毒等，這些病原菌與植物的互相作用就會導致植物疾病的發生，如白粉病就是由于真菌（白粉菌）入侵植物體造成的。所以植物發病從根本上講是病原菌與植物體之間的互相作用的外在表現。研究發現植物與病原互相作用的模式主要有兩種：基因對基因假說和防衛假說。

基因-基因假說：1971 年，Flor 提出病原與抗病基因分別編碼激發子和激發子受體，若激發子與其相應的受體識別即可激發植物的抗病反應，表現為抗病，否則表現為感病。這種抗性一般表現為顯性。防衛假說：該假說認為，病原物釋放一種效應因子，這些效應因子可以作用并修飾植物的某些目標蛋白，植物檢測到這種修飾之后可以觸發植物對病原的抗病性。防衛假說的提出改變了之前對抗病基因功能的認知，抗病蛋白不僅僅是被動的等待與病原蛋白結合，而是主動監視自身的生理變化，迅速啟動防衛反應（Axtell et al., 2003；Martin et al.2003;王明 2012）1.2.2 植物抗病基因的類型。

植物中克隆的第一個抗病基因是于 1992 年在玉米中克隆出來的，至今已有 10 多種植物中的70 多個抗病基因被克隆出來（Liu et al.,2007），通過對這些已克隆的基因的研究發現，大多數抗病基因中存在保守的序列：如富含亮氨酸的重復序列（LRR），核苷酸結合位點結構域（NBS），CC（coiled-coiled）結構域等，根據其主要結構域把抗病基因分成了以下幾個大類：

1、NBS-LRR 類抗病基因，這類抗病基因含有 NBS 和 LRR 的結構域。（Hammond-Kosack andParker, 2003）2、胞外 LRR 受體類，其編碼蛋白包含胞外 LRR 結構域和單個跨膜區，胞內不編碼激酶。甜菜中的 HS1 基因（Cai et al., 1997）3、擬南芥中發現的抗白粉病基因 RPW8，其編碼產物為一個攜帶 CC 結構域的膜蛋白（Xiaoet al.，2001）4、大麥抗禾柄銹菌基因 Rpg1，其編碼產物為一個帶有兩個激酶結構域的受體激酶類似蛋白\\(Brueggeman et al., 2002）5、編碼胞內絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，這類抗病蛋白包含丁香假單胞桿菌基因 Pto 和 PBS1，這兩個基因分別來源于番茄和擬南芥，屬于不同的亞家族。6、編碼胞外 LRR 類似受體激酶，編碼的蛋白一般包含胞外的 LRR 結構、單個的跨膜區和胞內的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶\\(Song et al.,1995; Gomez-Gomez et al., 2000; Sun et al.,2004\\)7、Mlo 基因：這是從大麥中克隆的一類抗白粉病的隱性基因。其一般包含 7 個跨膜區，其顯性基因的功能可能是抑制細胞程序性死亡，突變后幾乎對所有白粉病小種具有抗性（Buschgesetal.,1997）。

綜合以上幾種類型的抗病基因，最重要的是 NBS 類抗病基因。NBS 結構中包含三個關鍵基序：P-loop、Kinase2 和 Kinase3a。具有結合 ATP 或 GTP 及水解酶的活性。NBS 結構是基因內互作的關鍵部位，同時也參與不同基因同源結構互作\\(Rathjen and Moffett, 2003\\)。NBS 結構突變可顯著影響抗病基因的功能，例如 P2 基因的 NBS 結構內保守序列突變后，P2 基因基本喪失抗病功能\\(Dodds et al., 2001\\)。其次是 LRR 結構域，LRR 結構不盡是抗病蛋白與病原基因產物作用的部位，也決定抗原基因抗性專一性，在信號傳導中也有重要的作用，LRR 結構的突變也會顯著影響基因的抗病功能\\(Dinesh-Kumar et al.,2000；Bryan et al., 2000；Anderson et al.,1997\\)。有學者推測LRR 區是抗病基因產物和病原基因產物直接或間接作用的部位（Dangl and Jones，2001 ）。He etal（2000）通過實驗證明 LRR 決定抗病基因特異識別的激發子，而胞內激酶決定信號途徑。

1.2.3 黃瓜抗白粉病基因挖掘的研究

雖然學者們對黃瓜白粉病抗性基因進行了大量的 QTL 定位實驗，但是由于定位區域依然很大，缺少有效的手段進行進一步的精細定位，隨著生物信息學的發展，有的學者開始利用基因的同源性，預測黃瓜中的抗白粉病基因。Yang 等（2013）在黃瓜中預測了 67 個 NB-LRR 類型的抗病相關的同源基因。這些基因分布在黃瓜 7 條染色體上，其中可能有部分與白粉病抗病性有關Schouten（2014）利用擬南芥中已經發表的白粉病抗性相關基因和黃瓜基因組測序數據，在全基因組范圍內搜尋白粉病抗性基因，最終鑒定出 13 個 MLO-like 基因，10 個 AtPMR4 同源基因，一個 PMR5 同源基因，13 個 PMR6 同源基因。這些基因也是今后挖掘和驗證白粉病抗性候選基因的重點。

1.3 黃瓜白粉病抗性基因全基因組關聯分析（GWAS）

全基因組關聯分析（Genome-WideAssociation Study）是一項最早應用于人類疾病研究的技術，Science 雜志于 2005 報道了第一項具有年齡相關性的黃斑變性的 GWAS 研究（Klein，2005），隨后，陸續發表了一系列應用 GWAS 研究人類疾病的研究成果。隨著測序技術的發展，測序技術的成熟和測序成本的降低，一些重要模式生物和作物已經完成全基因組測序和重測序工作，所以，一些針對重要的動植物進行的 GWAS 研究也陸續進行。

1.3.1 關聯分析的優勢

植物中第一個應用關聯分析研究的性狀是玉米中開花時間的基因 dwarf8\\(d8\\),并隨后在擬南芥和其他作物中得到廣泛應用。關聯分析具有如下優勢：（1）不需要構建遺傳分離群體，縮短了研究時間并節約了成本；（2）連鎖作圖一般只有兩個親本，只能定位兩個等位基因，而關聯分析可以實現對一個基因座上多個等位基因的同時研究；（3）由于關聯分析使用的是自然群體，所依據的重組是長期進化積累下來的，相對于遺傳群體短時間內的有限次的重組，定位結果的分辨率更高，甚至可以直接找到基因；（4）關聯分析使用的標記距離都是以 bp 為單位，直接與物理位置對應，可以更加容易的將定位結果與基因進行整合。（Liu et al.,2011;王明，2012）關聯分析以長期重組交換保留下的位點之間的連鎖不平衡（linkage disequilibrium, LD）為基礎，獲得群體表型數據和基因型數據后，用統計學方法檢測位點多態性與性狀遺傳變異之間的關聯，也可稱之為連鎖不平衡作圖（Flint-Garcia et al., 2003）,LD 的衰減程度決定了關聯分析的分辨率。LD 衰減較快，關聯的分辨率高，定位基因的準確性也高，相反，LD 衰減慢，精度降低，定位區間會相應的加大。

1.3.2 連鎖不平衡與遺傳連鎖的關系：

經常會有人將連鎖不平衡與遺傳連鎖兩個概念混淆，實際上這是兩個完全不相同的概念，遺傳連鎖是通過計算兩個位點之間的重組率的大小來衡量，考慮的是兩位點之間在染色體上的距離的問題或者說是分布的狀態；而連鎖不平衡分析考慮的是不同的位點之間的相關性，只要兩個位點相對應的等位變異同時出現的概率大于群體中隨機組合的概率，就稱之為連鎖不平衡。由于如果兩個位點在染色體上位置較近，會導致其在群體中更容易同時出現，導致連鎖不平衡，這也是導致人很混淆這兩個概念的主要原因。連鎖不平衡主要來自于兩個因素：自然選擇和基因漂變，但是緊密的連鎖也會增加連鎖不平衡性。連鎖不平衡的度量本質上是實際觀測到的單倍型頻率與隨機分離時的期望頻率之間的差異。

1.3.3 植物中影響 LD 的主要因素

作物的交配系統是影響 LD 的主要因素。異交作物的 LD 衰減遠小于自交作物。例如玉米栽培種 LD 衰減距離一般在 1.5kb 左右\\(Remington et al., 2001\\)，而玉米自交系中 LD 衰減距離可達到100Kb（Rafalski et al.,2002）。除了交配系統，瓶頸效應也是 LD 的重要影響因素。作物馴化起始過程中，只有一小部分個體被選擇，基因型頻率收到了很大的選擇，只有小部分基因被保留下來，這種現象稱之為瓶頸效應。這種現象可以顯著增加 LD 的水平。另外研究群體的大小也是影響 LD 的重要因素，不難想象，如果群體過小，很容易使估測的 LD 過大。

1.3.4 關聯分析的一般步驟：

關聯分析大體上需要經過以下幾個步驟：群體構建、表型鑒定和基因型檢測、群體結構分析、關聯分析。具體如下：群體構建時一般需要考慮兩個方面：群體大小和材料多樣性，一般來說群體越大，多樣性越好，研究的結果也會越好，但是成本也會增加，一般先用分子標記對種質資源進行多樣性篩選，挑選出代表最廣泛多態性的最小群體。這樣篩選出來的群體我們可以稱之為核心種質。例如本實驗所用的關聯分析材料為黃瓜核心種質，是由從 3342 份種質中篩選出來的 115 個株系組成,代表了總遺傳多態性的 77.2%（Qi et al.,2013）。

表型的鑒定與變異分析：對于植物實驗，特別是材料是純合自交系，一般采取多年多點的重復鑒定來增加表型鑒定的準確性和穩定性。另外某些復雜性狀有多個指標對其進行評估，比如黃瓜果實大小，可以包括長、直徑、果重等可以通過主成分分析法，減少實驗數據的采集量，找出可以代表目標性狀表型的主成分因子，用其多為表型數據進行關聯分析?；蛐偷臏y定：隨著二代測序技術的成熟，SNP 分子標記被大量的用在關聯分析上，其具有以下方面的優勢：（1）標記數量多、密度大，有研究表明玉米和大芻草中，編碼區每 124bp 就存在一個 SNP 位點，非編碼區每 31bp 就有一個 SNP 位點；（2）檢測技術成熟，包括芯片技術和二代測序技術的成熟和廣泛應用，使SNP標記的檢測成本降低的同時也更加快捷\\(汪維鵬 等，2006\\)。

群體結構和親緣關系分析就是對群體中的個體進行組成分析，把所有的材料分成不同的亞群，這樣可以避免相同亞群內部 LD 強度偏大導致的假陽性。關聯分析所用的群體一般有如下五種：a、理想群體，具有較弱的群體結構和親緣關系；b、多家系群體，群體結構微弱但是包含多個家系；c、具有群體結構但是親緣關系較遠；d、既有群體結構又有親緣關系；e、具有高度群體結構和緊密親緣關系的群體。一般來說做植物，特別是農作物多數屬于第四種群體結構，所以必須進行群體結構和親緣關系的分析。進行群體結構和親緣關系分析需要用到覆蓋全基因組的分子標記，常見的如 SSR、SNP 等，一個 SSR 分子標記常有多種基因型，而數量較少；每個 SNP位點一般只有兩個基因型，但是數量巨大。所以如果是等量的分子標記的話，SSR 標記檢測的效率更高（Zhu et al.，2008）表型與基因型的關聯分析：Tassel 是關聯分析常用的軟件，關聯分析所用的模型主要有 GLM（一般線性模型）和 MLM（混合線性模型）。GLM 模型：y=markereffect + populationstructure +residual。在 Tassel 軟件中的 GLM 程序中將各個個體的 Q 值作為協變量，對標記分別與性狀進行回歸分析，計算量較少，運行時間短。MLM 模型需要先計算每個品系歸屬于各個亞群后 Q 矩陣和品系間親緣關系 K 矩陣。用以矯正群體結構和遺傳背景對檢測結果的影響，運行時間較長。

1.3.5 關聯分析在黃瓜研究中的應用

關聯分析已經在重要的糧食作物中取得了豐碩的成果，如下列出了在模式作物和重要糧食作物中取得的一些重要的研究進展：在擬南芥研究中的應用：Aranzana 等通過 GWAS 技術鑒定出擬南芥中控制開花時間和抗性相關的多個信號位點（涂雨辰，2013）。在玉米育種中的應用：如 2011 年通過全基因組關聯分析技術確定了一些與葉片結構相關的關鍵基因（Laurie et al.,2004）。在大豆分子標記研究中的應用：

在大豆中關聯到一些重要的位點，這些位點與一些重要的農藝性狀有關，對作聲生產實踐具有重大的指導作用\\(Yang et al.,2010;Palmer et al.,2004\\)。在水稻重要基因定位方面的應用：通過 GWAS技術，檢測到 1 個控制花期的信號位點和多個與生產性狀關聯的位點\\(Arite et al.,2009\\)。雖然關聯分析相對于傳統的基因定位技術具有更高的效率和準確性，在重要的作物中也取得了不錯的成果，但是關聯分析現在在黃瓜基因功能研究中的應用尚未見報道，不過隨著測序技術的成熟，以及分析技術的發展，關聯分析將會更加廣泛的應用在基因定位和功能研究中。

1.4 本研究的目的意義與技術路線

1.4.1 研究目的與意義

白粉?。╬owdery mildew）是嚴重影響黃瓜生產的一種病害，常造成重大的經濟損失，生產上常采用過量使用殺菌劑來進行防治。大量使用藥劑防治造成了生產成本增加和嚴重的環境污染。培育抗病新品種成為最經濟、最有效的手段，所以開展對黃瓜白粉病抗性遺傳規律的研究和抗病基因的克隆具有重要的實際意義。根據前人報道種質資源 PI 200815 含有抗白粉病基因 pm-3，不同于 Natsufushinari 中的 pm-1 和 pm-2 基因，也不同于控制黃瓜下胚軸抗性的 pm-h 基因。截至到目前為止，對于 PI 200815 中 pm-3 基因的定位研究尚未見報道。本研究以高抗和高感白粉病的兩個材料作為抗病親本，配制遺傳群體，對抗性親本中的抗病基因進行遺傳規律分析。利用黃瓜全基因組測序開發的 SSR 分子標記，對抗病基因進行定位研究，分析候選基因，為今后分子標記輔助育種和解析抗病機制奠定基礎。同時利用核心種質，通過全基因組關聯分析技術，對黃瓜白粉病抗性進行全基因組關聯分析，在全基因組范圍內，挖掘抗白粉病基因。這樣不僅可以關聯到更全的基因，還可以將不同學者的研究結果進行整合分析，為綜合利用黃瓜中的抗白粉病遺傳資源提供依據。

1.4.2 技術路線