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第二章 黃瓜種質 PI200815 抗白粉病基因定位研究

目前已有多篇報道對黃瓜白粉病抗病基因進行了遺傳分析和定位研究，研究結果也各不相同。PI 200815 是一份起源于緬甸的抗白粉病種質材料，kooistra（1968，1971）對其抗性進行了遺傳分析，認為其抗性由隱性單基因控制，截至到目前為止，尚未有關于這份抗病種質中抗病基因的定位研究。本實驗利用 PI 200815 與一份感病材料（新泰密刺選系 931）進行雜交、自交構建遺傳分離群體，對其抗病基因進行了遺傳分析和定位研究。

2.1 材料與方法

2.1.1 實驗材料

本實驗所采用的研究材料由中國農科院蔬菜花卉所黃瓜課題組提供，母本 P1為高抗白粉病的純合自交系 PI200815，果肉呈橙黃色，對白粉病表現為抗病。父本 P2是從栽培種新泰密刺中選育出的純合自交系 931，屬于典型的華北類型黃瓜，對白粉病表現為感病。以 P1、P2為親本進行雜交，F1自交得 F2，收獲 186 個 F2單株，F2繼續自交獲得 F3家系。

2.1.2 白粉病抗病性鑒定

2.1.2.1 材料準備

抗病鑒定于2013~2014年在中國農業科學院蔬菜花卉研究所溫室內進行。實驗材料包括雙親、F1、F2及其 F2:3家系（186 份）。鑒定在 3 個季節進行：2013 年春季利用病圃對 F2進行成株期田間自然發病抗病鑒定（2013S），2014 年春季對 F2：3家系進行苗期人工接種抗病性鑒定（2014S）以及 2014 年秋季對 F2：3家系進行人工接種抗病性鑒定（2014A）。在實驗 2013S 中，將 186 個F2單株育苗后定植于溫室中。在實驗 2014S 和 2014A 中，將 F2：3家系直接播種于營養缽內，分三次重復，每重復 5 株，隨機區組排列。

2.1.2.2 菌源制備

白粉病苗期人工接種鑒定采用孢子懸浮液噴霧的接種方法。采集自然發病的黃瓜白粉病病株上的新發生的病葉，用毛刷刷取葉片典型病斑上的孢子（單絲殼白粉菌 Sphaerotheca fuliginea）于盛有無菌水的燒杯中、過濾，加入 SDS（1g/mL），高速攪拌 10 分鐘，用血球記數法統計濃度，制備成濃度為 5×105/mL 的孢子懸浮液，用于接種。

2.1.2.3 接種、管理方法

在實驗 2013S 中，采用病圃（該溫室連年種植黃瓜，白粉病發生嚴重）田間鑒定，田間常規管理，所以無需進行人工接種，待其自然發病后，調查每株第 3~8 片真葉的病情級別，計算病情指數。在實驗 2014S 和 2014A 中，幼苗于第三片真葉展平時，進行噴霧接種，用小型手持噴霧器將制備好的懸浮液均勻地噴于黃瓜葉片上，以葉片正反面有水滴流淌為度。接種后黑暗保濕（相對濕度為 78%~80%）12~16 小時，之后每天光照 14 小時，并不再保濕，溫度一般控制在白天：25℃~28℃，晚上：20℃~22℃之間。

2.1.2.4 病情調查和數據處理

接種 15d 后調查發病情況。根據接種葉片上的發病情況進行病情評級，評級標準見表 1，計算病情指數（DI）。病情指數計算方法：病情指數=∑（每個病級的植株數×級別數）/（總植株數×最高級別數）×100，F2：3家系最終病指取三次重復的平均值。

黃瓜白粉病病情分級標準：

0 級：無病斑

1 級：病斑面積小于葉片面積 1/3

3 級：病斑面積大約介于葉片面積 1/3~2/3

5 級：病斑面積大于葉片面積 2/3，病斑連成片

7 級：白粉覆蓋整個葉片，葉片開始變黃

9 級：葉片變褐，開始部分壞死，葉緣上卷

黃瓜白粉病群體抗性分級標準：

高抗（HR）： 0＜病情指數≤15；

抗?。≧）： 15＜病情指數≤35；

中抗（MR）： 35＜病情指數≤55；

感?。⊿）： 55＜病情指數≤80；

高感（HS）： 病情指數＞80

對三次實驗調查的病情指數進行整理分析，用 Microsoft Excel 2003 計算遺傳參數并繪制頻數分布圖，分析后代分離規律，2.1.3 構建 SSR 連鎖圖譜。

2.1.3.1 黃瓜基因組 DNA 的提取

2.1.3.1.1 黃瓜材料的準備

采集雙親、F1和所有 F2單株葉片，提取其基因組總 DNA 放于-20℃冰箱內暫時儲存，把各份材料在冷凍干燥機中進行干燥處理\\(約 24h\\)，凍干后將其搓成粉末，封口，放入低濕度儲存柜內保存，待用。

2.1.3.1.2 DNA 提取

采用改良 CTAB 法提取樣品全基因組 DNA，具體操作步驟見附錄 22.1.3.1.3 基因組 DNA 濃度的檢測。采用瓊脂糖凝膠電泳對 DNA 濃度進行檢測，具體操作步驟見附錄 22.1.3.2 SSR 標記分析。

2.1.3.2.1 SSR 標記來源

基于國際黃瓜基因組測序計劃設計的 2112 對 SSR 引物（任毅, 2009）。上述引物均由上海生物工程公司合成。用親本對所有 SSR 引物進行篩選，完成后得到的多態性引物用于構建遺傳圖譜。

2.1.3.2.2 親本篩選多態性 SSR 引物

首先用 2112 對 SSR 引物對雙親對進行篩選，找出具有多態性的引物。用所有在雙親上表現出多態性的引物對 F2群體進行 SSR 分析，構建遺傳圖譜，SSR 反應體系和程序見附錄 22.1.3.2.3 凝膠電泳檢測。本實驗采用聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）對 PCR 產物進行電泳檢測（凝膠濃度為 6%），顯色采用銀染法，詳見附錄 2。

2.1.3.2.4 PCR 擴增結果統計

按照作圖軟件（JionMap 4.0）的使用說明，對電泳條帶進行統計和數據整理，具體方法見附錄 2。

2.1.3.3 SSR 連鎖群的構建

構建連鎖群所使用的軟件為 Join Map 4.0，先把 Excel 表中的原始數據進行處理，轉化成軟件中 F2群體所需格式，然后進行數據的處理和分析，詳見附錄 2。

2.1.4 黃瓜白粉病抗病基因的 QTL 分析

把整理好的 F2或 F2:3家系的表型調查結果用 Excel 整理，把其改為*.qua 文件格式保存。整理 JoinMap 4.0 作圖軟件的結果，把兩者結果相相結合，采用 MapQTL 4.0 軟件分析，以復合區間作圖法\\(MQM\\)分別按不同季節進行白粉病抗性相關基因的 QTL 定位。詳見附錄 22.1.5 主要試劑、儀器設備。

實驗中所用到的試劑和儀器參見附錄 3

2.2 PI200815 抗病基因定位結果與分析

2.2.1 遺傳群體抗病性鑒定結果

2013 年春，對雙親及 186 株 F2群體進行田間成株期抗病性鑒定（2013S）。結果顯示，抗病親本 P1的病情指數為 2.7，表現為高抗；感病親本 P2的病情指數為 59.3，表現為感??；F1的病情指數為 38.7，介于雙親之間。F2群體中病情指數呈現連續分布，這表明，抗病親本中含有的抗白粉病性狀可能是由數量基因控制。

2014 年春和 2014 年秋，對雙親和 186 株 F2對應的的后代 F2：3家系進行了苗期人工接種抗病性鑒定（2014S 和 2014A），在 2014S 中雙親鑒定結果與 F2結果基本一致，感病親本 P2病情指數達到 52.3，表現為感病，而抗病親本為 2.4，仍然表現為高抗。在實驗 2014A 中，結果類似。

表 2.1 P1、P2、F1、F2和 F2：3家系三次抗病性鑒定病指分布

圖 2.1 F2或 F2：3群體病情指數分布圖

2.2.2 SSR 多態性分析

采用 PAGE 技術篩選在雙親間表現為多態性的引物，從黃瓜基因組測序后開發的 2112 對 SSR引物有中 129 對引物在兩親本間有多態性且擴增條帶清晰的引物，部分 SSR 引物在親本間的擴增情況見圖 3.2。

圖 2.2 SSR 引物在親本 P1（PI200815）和 P2（931）間的擴增結果

2.2.3 遺傳圖譜的構建

將篩選出的 129 對引物，在 F2群體上進行擴增分析并用 Jionmap 軟件構件連鎖圖譜。獲得了一張包含 8 個連鎖群的遺傳圖譜，可與黃瓜 7 條染色體一一對應（其中兩條連鎖群均對應到 3 號染色體上）。這個遺傳圖譜公包含 129 個 SSR 標記。這張遺傳圖譜的總長度為 857.9cM，標記間的平均遺傳距離為 6.65cM。表 2.2 中列出每條染色體上標記的分布情況。

表 2.2 遺傳圖譜上 SSR 分子標記分布情況

圖 2.3 黃瓜 F2群體 SSR 遺傳圖譜

2.2.4 黃瓜抗白粉病 QTL 定位分析

我們利用三年的抗性鑒定結果和構建的遺傳圖譜，利用 JionMap 4.0 的復合區間作圖法作圖法（MQM），對白粉病抗性基因進行了 QTL 定位分析，結果如下：2013S 中，分別在黃瓜 Chr1、Chr6 上檢測到 1 個 QTL 位點：pmQTL1.1 和 pmQTL6.1，pmQTL1.1的 LOD 值為 4.6，表型解釋率為 10%；其位于標記 SSR03860-SSR14445 之間，兩側翼標記之間的遺傳距離為 2cM。pmQTL6.1 的 LOD 值為 3.31，表型解釋率為 7%，其位于標記SSR18251-SSR01148 之間，兩側翼標記之間的遺傳距離為 7.3cM。2014S 和 2014A 中，只檢測 pmQTL1.1，LOD 值分別達到了 15.3 和 4.9，表型解釋率分別為37.9%和 21.6%（詳見表 2.3）。

表 2.3：三次實驗對白粉病抗性的 QTL 定位結果

綜合表中數據可以看出，只有 pmQTL1.1 這個 QTL 位點可以被重復檢測到。且 LOD 值較高，即可信度較高，表型解釋率也達到了 37.9%。pmQTL6.1 只有在成株期（2013S）抗性鑒定的結果中檢測到。

圖 2.4 黃瓜白粉病抗性基因的 QTL 定位

圖 2.5 白粉病抗性基因的 QTL 分析\\(坐標軸上的線改用黑色\\)

2.2.5 主效 QTL 區域基因預測

利用黃瓜全基因組測序（Huang et al.，2009）提供的基因組預測、注釋結果，對黃瓜白粉病抗性相關的主效 QTL（pmQTL1.1）所在區域進行了序列比對和分析。發現目標區域兩側翼標記分別為 SSR03860 和 SSR14445，他們直接的物理距離為 689Kb，共有 95 個預測基因。其中包括：

轉錄因子，細胞分裂周期蛋白，糖類轉運蛋白，脫氫酶，超氧化物歧化酶等多種功能的基因，其中還有 10 個基因與抗性直接相關：2 個 NBS-LRR 類型抗病蛋白，5 個緊挨著的抵御素類似基因，2 個逆境調控的蛋白，1 個調控植物細胞程序性死亡的基因。（詳見表 2.4）

表 2.4 黃瓜白粉病幼苗抗性相關基因的預測結果

2.3 討論

黃瓜是全世界范圍廣泛栽培的一種蔬菜，白粉病是黃瓜生產上重要的病害，常造成嚴重的經濟損失，所以國內外專家學者對黃瓜白粉病抗病基因進行了諸多研究。在遺傳分析方面存在諸多不同的觀點。造成這種現象的主要原因可能有以下幾點：1、專家學者選用的研究材料本身抗病基因不同。例如 Kooistra（1968）經遺傳分析認為 Natsufushinari 中含有兩個白粉病抗性基因，而 PI 200815 中含有第三個抗白粉病基因。2、不同學者研究時所采用的抗病鑒定方法不同，如環境的溫度濕度不同、病情調查方法不同等。3、白粉菌的生理小種不同。

本實驗通過抗感雙親構建遺傳群體，并且構建了覆蓋全基因組的遺傳圖譜，對白粉病抗性基因進行 QTL 定位研究，在三個季度實驗中，檢測到一個穩定的主效的 QTL 位點，表型解釋率最高達到了 37.9%，LOD 值也達到 15.3。Kooistra（1968）曾報道認為 PI200815 中白粉病抗性為隱性單基因控制，后來被命名為 pm-3 基因。這與本實驗的結果有一定的一致性，本實驗只定位到一個主效 QTL，且表型解釋率很高，所以我們推測本研究定位到的 QTL 位點 pmQTL1.1 就是前人報道的 pm-3 基因。

在模式作物中，白粉病的抗性基因有很多已被克隆，這些已克隆的基因可以為挖掘黃瓜中的抗病基因提供參考。利用同源基因的相似性，在黃瓜中搜索抗病基因的同源基因。目前研究較多的有 MLO 家族基因和 PMR 家族基因。這些基因可以作為定位結果的候選基因進行預測或者直接進行轉基因進行功能驗證。