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第三章 黃瓜白粉病抗病基因的全基因組關聯分析

黃瓜白粉病的抗性機制十分復雜，從之前的 QTL 定位研究結果看，不同的抗病材料所攜帶的抗病基因不同。同一份抗病材料也可能攜帶不止一個抗病相關基因，且顯隱性也各不相同。如何從廣泛的遺傳資源中綜合全面地挖掘抗病基因一直是一個難以解決的難題，按照之前的研究思路一般是先通過基因定位然后進行基因克隆，但是這種方法只能對個別抗病材料中的抗病基因進行挖掘，難以進行綜合研究。隨著二代測序技術的發展，全基因組關聯分析（GWAS）技術成為了研究復雜性狀的一種非常有力的研究工具，基于統計學的相關性分析，可以直接利用自然群體進行基因定位研究?，F已在人類和重要的植物模式作物中取得了不少研究成果。本實驗利用已構建的黃瓜核心種質，進行 GWAS 研究，在全基因組范圍內挖掘黃瓜白粉病抗性基因。

3.1 GWAS 材料方與法

3.1.1 實驗材料

本實驗所采用的研究材料由中國農科院蔬菜花卉所黃瓜課題組提供的黃瓜115份核心種質材料，由于部分材料缺失，實驗實用 109 份材料。這份核心種質是從來自世界各地 3000 多份種質中篩選出來的，詳見齊建建（2014）。整個核心種植群體均完成了全基因組的重測序（Qi et al.2013），測序數據見黃瓜基因組核心種質抗病性鑒定。

3.1.2.1 材料準備

鑒定于 2013~2014 年在中國農業科學院蔬菜花卉研究所內和順義實驗基地的溫室進行。鑒定實驗分 3 次進行：2013 年春，2013 年秋和 2014 年春。按照田間正常管理，進行田間成株期自然發病下的抗病性鑒定。所有株系分三個重復，每個重復種質 6 株。

3.1.2.2 病情調查和數據處理

抗病性鑒定采用的方法是成株期自然發病，所以不需要接種，待所有株系充分發病后，進行病情調查，調查和數據統計方法參照上一章節。不同季度抗病鑒定的結果進行相關性分析，所用的軟件為 SAS V9.2。

3.1.3 全基因組關聯分析

3.1.3.1 群體結構和連鎖不平衡分析

利用 STRUCTURE V2.3.1 進行群體結構分析，由于使用的是相同一份核心種質，詳細步驟和結果可參見 Qi et al（2013）。本實驗為了簡化群體結構復雜性對 GWAS 結果的影響，K 值取為 3。連鎖不平衡分析方法也結果也參見 Qi et al（2013），本實驗直接使用該研究的結果，做后續分析。

3.1.3.2 黃瓜白粉病抗性關聯分析

利用 TASSELV3.0 進行白粉病抗性基因的關聯分析，選用一般線性模型（GLM），對 SNP 標記與表型數據進行全基因組關聯分析。用 TASSEL 自帶的畫圖功能繪出曼哈頓圖。

3.2 GWAS 結果與分析

3.2.1 抗病性鑒定結果

分別于 2013 年春（pm_2013）、2014 年春\\(pm_2014_s\\)、2014\\(pm_2014_a\\)年秋三個季度對核心種質材料進行了抗白粉病鑒定。并對鑒定結果進行了統計分析（詳見圖 3.1 和表 3.1）。

從抗病鑒定的結果來看，抗性材料在三個季度中的表現均比較一致，如 CG7、CG9、CG32、CG44、CG101 在三個季度中均表現為高抗，病情指數低于 5，另有 CG70 和 CG82 連續兩個季度均表現出完全抗性。感病性狀表現穩定的株系包括 CG28、CG62、CG78、CG109、CG120 等，這三個株系的最低病指都大于 45。但是有的中抗或中感的材料表現較不穩定。三個季度的變異系數介于 52.7%和 80.0%之間。

表 3.1 核心種質群體三個季度抗病鑒定病指統計

3.2.2 全基因組關聯分析

利用核心種質三個季度的抗病性鑒定的結果與 SNP 標記進行全基因組關聯分析，并繪制曼哈頓圖，如圖 3.1?？梢园l現，有多個信號位點被檢測到。關聯分析所用的 SNP 數據來源于 Qi et al.（2013）和黃瓜基因組從檢測結果來看，在三個季度中共監測到 6 個信號區域，全部出現在 2013 季度實驗中。其中 pmG2.1、pmG5.2 和 pmG5.3 在后續兩個季度的實驗中被重復檢出，是表達穩定的抗性位點。然后選取各個信號區間內-log P 值最高的 SNP 的物理位置代表其所在的區段，詳見表 3.2.

圖 3.1：核心種質三個季度抗病鑒定 DI 頻數分布和全基因組關聯分析曼哈頓圖

表 3.2 GWAS 關聯分析信號位點代表 SNP 標記信息

3.2.3 關聯分析結果與 QTL 結果比較

將 GWAS 檢測到的 6 個信號位點的位置與前人 QTL 定位結果進行了比對，發現三個穩定表達的位點與之前定位的 QTL 位點基本一致。詳見表 3.3，另外有 pmG2.1 和 pmG4.1 未找到相對應的 QTL 位點。

表 3.3 GWAS 位點與前人 QTL 定位結果比對

3.3 討論

本實驗通過對黃瓜核心種質進行了三個季度的抗病性鑒定，結合重測序數據進行了全基因組關聯分析，最終檢測到 6 個信號區域，其中 3 個與前人 QTL 定位結果基本一致，分別為：pmG1.1、pmG5.2、pmG5.3，特別是 pmG5.3 這個位點，不僅是本實驗檢測到的信號最強的位點，也是前人QTL 定位到的次數最多的一個區域，說明 GWAS 在黃瓜白粉病抗性基因檢測中的應用是有非常效并且可靠的。另外的 3 個位點并沒有被之前的 QTL 實驗檢測出來，我們推測可能是因為此具有此位點抗性基因的材料還并未被研究人員所研究。pmG2.1 在三年的 GWAS 分析中都檢測到，并且信號很強，但是根據前人的 QTL 分析結果發現，2 號染色體上并未檢測到抗性相關區域，可能就屬于這種情況。

因此，下一步可以根據 GWAS 結果，采用生物信息學方法的手段，將抗性材料與其對應的抗性位點一一對應，然后通過構建遺傳群體等方法，分別進行遺傳定位，驗證 GWAS 結果的可靠性，深入挖掘白粉病抗性基因。黃瓜白粉病抗性是一種遺傳特別復雜的性狀，往往涉及到多個基因或多條代謝通路。使用基因定位的手段往往只能定位到對性狀影響最顯著的幾個基因，并且由于不同的抗病材料具有不同的抗病基因，不可能從一個群體或者一份材料中克隆出所有與白粉病抗性相關的基因。但是GWAS 技術的出現解決了這一難題，黃瓜核心種質包含了大多數的遺傳變異，代表了最廣泛的遺傳多樣性，可以同時對所有的遺傳資源中的抗病基因進行檢測，在全基因組范圍挖掘抗病基因。GWAS 為全面的研究白粉病抗性機制，提供了一個非常有效的手段。