連作障礙是指在同一塊田地連續種植同一種（科）作物導致產量降低、品質變劣、土壤物質生產性能變差的現象[1-2].早在公元前 300 年， 人們就已經發現了連作障礙， 但由于傳統農業的輪作倒茬與精耕細作， 因此并未造成嚴重損失.進入現代農業，長期連作引發的作物大面積減產、土傳病害發生等在全國各地普遍存在。如黑龍江東北部大豆（Glycinemax）重迎茬面積已達 70%以上, 與正茬相比引起的減產幅度可達 10%~40%.水稻（Oryza sative）、辣椒（Capsicum annuum）、西瓜（Citrullus vulgaris）等長期種植也會引發土傳病害加劇， 導致作物產量顯著下降[6-8].連作障礙是土壤-植物-微生物等諸因素綜合作用的結果， 與土壤微生物區系失衡、植物營養吸收差異性及根系次生代謝化感物質等密切相關[9-11].谷巖等研究發現大豆長期連作的土壤脲酶和轉化酶活性降低， 真菌和細菌磷脂脂肪酸分析（PLFAs）比例顯著增加。馬鈴薯（Solanum tuberosum）連作則增加了鐮刀菌（Fusarium spp.）和大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）的種群或個體數量， 這些真菌是導致馬鈴薯土傳病害的主要致病菌類型（試驗結果未發表）。王志剛等研究表明， 根際土壤過氧化氫酶與多酚氧化酶活性隨韭菜（Allium tuberosum）連作年限的增加而降低?？梢?， 長期連作明顯影響了土壤微生物種群數量與群落結構， 導致病原微生物擴增并造成病害型連作障礙。保持農田土壤微生物群落多樣性對提高土壤生物活性、減輕土傳病害具有重要意義。

作為農業支柱產業， 棉花（Gossypium hirsutum）種植面積占新疆作物總面積的 50%~70%, 有些地區甚至達到 90%.多年連作導致棉花枯、黃萎病加劇， 嚴重威脅新疆棉花可持續生產。前人對新疆棉花枯萎?。‵usarium oxysporium spp.）、黃萎病病菌（Verticillium dahliae）的研究主要集中在致病菌的分離鑒定、可培養菌系的數量動態變化等方面， 從農田土壤致病菌與拮抗菌多樣性角度， 研究長期連作對滴灌棉田土壤鐮刀菌和枯草芽孢桿菌群落結構的影響鮮有報道。

本試驗在北疆石河子莫索灣墾區選取 5 年、10年和 15 年連作棉田典型樣地， 通過酶學和微生物分子生態學技術對長期連作棉田土壤酶活性、致病菌與拮抗菌群落結構多樣性進行了研究， 試圖揭示土壤酶活性與致病菌、拮抗菌群落多樣性對北疆棉區棉花長期連作的響應， 為構建健康土壤微生物區系及棉田土傳病害防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗設置

試驗區基本情況： 新疆第八師莫索灣墾區147團（44°54′~44°69′N, 85°98′~86°13′E）， 位于天山北麓準葛爾盆地南緣瑪納斯河中游沖積平原， 屬綠洲灌溉農業區。年均≥10 ℃積溫為3 600~3 750 ℃ ,年降水量為158.5~172.4 mm, 無霜期155~178 d.供試土壤屬灌耕灰漠土（灌淤旱耕人為土， calcaric fluvisals），pH 8.03, 有機質10.42 g·kg-1, 土壤礦質氮57.63 mg·kg-1,有效磷10.27 mg·kg-1, 有效鉀379 mg·kg-1.試驗選取不同種植年限的棉田（147團21連）， 分別為5年棉花連作（CtN5）， 樣地面積0.5 hm2; 10年棉花連作（CtN10）， 樣地面積1 hm2; 15年棉花連作（CtN15）， 樣地面積3 hm2.

1.2 樣品采集

采用多點混合法以“S”型路線在樣地上采集0~20 cm耕層土壤， 在樣點附近取12鉆為1個混合樣， 共3個混合樣。土樣采集后， 一部分存放在4 ℃冰箱， 用于測定酶活性； 另一部分存放在-80 ℃冰箱， 用于土壤DNA提取和后續PCR-DGGE分子生物學指標測定。

1.3 土壤酶活性測定

土壤過氧化氫酶活性采用微量滴定法測定（5 g土， 0.5 h）， 結果以1 g土壤在30 min消耗的高錳酸鉀的毫升數表示[15].蔗糖酶采用二硝基水楊酸比色法（5 g土， 37 ℃ , 24 h），顯色強度在分光光度計508 nm波長測定， 酶活性用24 h后1 g土壤中葡萄糖的毫克數表示[15].芳基硫酸酯酶采用對硝基苯硫酸鉀比色法（5 g土， 37 ℃ , l h），顯色強度通過分光光度計410 nm波長測定， 結果以每小時1 g土壤中釋放出的對硝基苯酚微克數表示[16].脫氫酶采用TTC比色法（6 g土， 37 ℃ , 24 h），顯色強度通過分光光度計485 nm波長測定， 結果以每小時1 g土壤中釋放出三苯基甲臜（TPF）的微克數表示[17].蛋白酶采用以酪蛋白做底物的方法（2.5 g土， 50 ℃ , 2 h），顯色強度通過分光光度計700 nm波長測定， 結果以2 h后1 g土壤中酪氨酸的微克數表示[17].

1.4 土壤 DNA 及微生物群落結構與多樣性測定土壤總 DNA 的提取采用 PowerSoilTMDNAIsolation Kit（MO BIO Laboratories Inc.USA）。試驗所用引物和 Taq 酶試劑盒均由大連寶生公司生產。

1.4.1 細菌 16S rDNA V6 區 PCR 擴增及變性梯度凝膠電泳（DGGE）。細菌 16S rDNA V6區 PCR擴增采用通用引物對F968-R1401, 引物序列見表 1.PCR 擴增條件為：94 ℃變性 5 min, 接著 20 個循環（94 ℃變性 1 min,67 ℃退火 1 min, 72 ℃延伸 1 min, 每個循環退火溫度降 0.5 ℃ ），然后 15 個循環（94 ℃變性 1 min, 57 ℃退火 1 min, 72 ℃延伸 1 min, 每個循環退火溫度降0.5 ℃） ,最后再 72 ℃延伸 10 min.產物片段長度 450 bp.土壤中總細菌（16S rDNA）PCR 產物進行 DGGE 分離時， 使用 7%的膠， 變性濃度 45%~55%, 緩沖液為 1?TAE 溶液， 電泳條件： 電壓 110 V, 溫度 60 ℃， 時間 17 h.

1.4.2 真菌 ITS 18S rDNA PCR 擴增及變性梯度凝膠電泳（DGGE）。真菌 ITS 18S rDNA PCR 擴增采用通用引物對ITS1F-ITS2, 引物序列見表 1.PCR 擴增條件為：94 ℃變性 5 min, 接著 36 個循環（94 ℃變性 30 s, 56 ℃退火 1 min, 72 ℃延伸 1 min）， 最后再 72 ℃延伸10 min.產物片段長度 300 bp.土壤中真菌（ITS 區）PCR產物進行 DGGE 分離時， 使用 8%的膠， 變性濃度30%~50%, 緩沖液為 1?TAE 溶液， 電泳條件： 電壓110 V, 溫度 60 ℃ ,時間 17 h.

1.4.3 鐮刀菌 Nest PCR 擴增及變性梯度凝膠電泳（DGGE）Fusarium Nest rDNA PCR 擴增采用通用引物對EF 1-EF 2 和 Alfie1F-GC-Alfie2R, 引物序列見表 1.

第 1 輪反應中， 每 25 μL 反應體系含有1 μL 10 mmol·L-1EF 1 溶液， 1 μL 10 mmol·L-1EF 2 溶液， 2 μL 2.5 mmol·L-1each dNTPs, 2.5 μL 10×PCR Buffer, 0.2 μL Taq PlusDNA Polymerase（上述所有藥品均購自大連寶生公司）， 3 μL 土壤總 DNA 溶液， 再加無菌去離子水至25 μL.PCR 擴增條件為： 94 ℃變性 5 min, 接著 43 個循環（95 ℃變性 45 s, 50 ℃退火 45 s, 72 ℃延伸 45 s），最后再72 ℃延伸10 min.第1輪產物片段長度1 000 bp,此處并非只有 1 條很顯著的特異性條帶， 而是有很多條非特異性條帶， 并不影響第 2 輪擴增。第 2 輪反應中， 每 25 μL 反應體系中， 含有 1 μL 10 mmol·L-1Alfie1F-GC 溶液， 1 μL 10 mmol·L-1Alfie2R 溶液，2 μL 2.5 mmol·L-1each dNTPs, 2.5 μL 10×PCR Buffer,0.2 μL Taq Plus DNA Polymerase（上述所有藥品均購自大連寶生公司）， 3 μL 第 1 輪 PCR 產物后的 DNA溶液， 再加無菌去離子水至 25 μL.PCR 擴增條件為：94 ℃變性 3 min, 接著 30 個循環（92 ℃變性 30 s, 55 ℃退火1 min, 68 ℃延伸45 s）， 最后再68 ℃延伸15 min.

第 2 輪產物片段長度 500 bp.進行 PCR-DGGE 電泳條件： 使用 6%的膠， 變性濃度 40%~60%, 緩沖液為1×TAE 溶液， 電壓 110 V, 溫度 60 ℃ ,時間 17 h.1.4.4 枯草芽孢桿菌 Nest PCR 擴增及變性梯度凝膠電泳（DGGE）Bacillus Nest rDNA PCR 擴增采用通用引物對BACF-R1378 和 F968-R1378, 引物序列見表 1.第 1輪反應中， 每 25 μL 反應體系含有 1.5 μL 10 mmol·L-1BACF 溶液， 1.5 μL 10 mmol·L-1R1378 溶液， 2 μL2.5 mmol·L-1each dNTPs, 2.5 μL 10×PCR Buffer,0.25 μL Taq Plus DNA Polymerase（上述所有藥品均購自大連寶生公司）， 2 μL 土壤總 DNA 溶液， 再加無菌去離子水至 25 μL.PCR 擴增條件為： 94 ℃變性5 min, 接著 2 個循環（94 ℃變性 1 min, 63 ℃退火1 min, 68 ℃延伸 2 min）， 然后再 2 個循環（94 ℃變性1 min, 61 ℃退火 1 min, 68 ℃延伸 2 min）， 隨后再 2個循環（94 ℃變性 1 min, 59 ℃退火 1 min, 68 ℃延伸2 min）， 緊接著再 2 個循環（94 ℃變性 1 min, 57 ℃退火 1 min, 68 ℃延伸 2 min）， 之后再 22 個循環（94 ℃變性 1 min, 55 ℃退火 1 min, 68 ℃延伸 2 min）， 最后再 68 ℃延伸 15 min.產物片段長度 1 300 bp.

第 2 輪反應中， 每 25 μL 反應體系中， 含有 1.25 μL10 mmol·L-1F968-GC 溶液， 1.25 μL 10 mmol·L-1R1378 溶液， 2 μL 2.5 mmol·L-1each dNTPs, 2.5 μL10×PCR Buffer, 0.2 μL Taq Plus DNA Polymerase（上述所有藥品均購自大連寶生公司）， 3 μL 第 1 輪 PCR產物稀釋 2 萬倍后的 DNA 溶液， 再加無菌去離子水至 25 μL.PCR 擴增條件為： 94 ℃變性 3 min, 接著30 個循環（92 ℃變性 30 s, 55 ℃退火 1 min, 68 ℃延伸 45 s）， 最后再 68 ℃延伸 15 min.產物片段長度410 bp.進行 PCR-DGGE 電泳條件： 使用 7%的膠，變性濃度 50%~65%, 緩沖液為 1×TAE 溶液， 電壓110 V, 溫度 60 ℃ ,時間 17 h.

以上 PCR 擴增片段均經 1.5%瓊脂糖進行目標基因檢測， DGGE 使用 SYBR?Gold nucleic acid gelstain（USA）染色 20 min.

1.5 數據處理DGGE指紋圖譜分析借助于Photoshop7.0進行圖片調整， Gel-QuantTM1.0軟件（Multiplexed Biotechno-logies Inc, USA）進行條帶判讀、遷移率、強度、面積計算， 采用UPGMA（unweighted pair group methodusing arithmetic average）方法進行聚類分析， 再根據 Primer 6.0 軟 件 （Plymouth, United Kingdom） 對DGGE指紋圖譜進行PCA分析。根據條帶的相對位置和相對強度計算Shannon-Wiener 指數（H）和Simpson均勻度指數（E）來評價微生物的多樣性[22].

式中： Pi為第 i 個物種在全部樣品中的比例（Pi=ni/N,ni為第 i 個物種的個體數， N 表示每個樣品中檢測到的條帶數）， S 表示 DGGE 檢測到的每一泳道的條帶總數即種的數目。數據分析采用 Excel 2010 和 SPSS17.0 統計分析軟件進行處理， 處理間的差異顯著性采用 Duncan 法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 棉花連作對土壤酶活性的影響

過氧化氫酶、蔗糖酶、芳基硫酸酯酶、脫氫酶及蛋白酶反映土壤生物活性與代謝功能[7,12].由表 2可知， 長期連作對棉田土壤過氧化氫酶、蔗糖酶、芳基硫酸酯酶、脫氫酶和蛋白酶活性均有明顯影響。過氧化氫酶活性在 CtN5 處理最高， CtN15 處理最低。蔗糖酶活性在各處理間表現為： CtN5>CtN10>CtN15.

CtN10 和 CtN15 處理的脫氫酶活性較 CtN5 處理分別降低 42.6%和 49.5%（P<0.05）。隨著棉花連作年限的增加， CtN5 處理的過氧化氫酶、蔗糖酶、脫氫酶活性分別比 CtN15 處理高 20.2%、141.3%、97.9%（P<0.05）， CtN15 處理的過氧化氫酶、蔗糖酶和脫氫酶活性分別比CtN10處理下降15.0%、6.4%和12.0%,比 CtN5 處理下降 16.8%、58.6% 和 49.5% （P<0.05）。芳基硫酸酯酶、蛋白酶在棉花連作 5~15 年中先降低后升高?？傮w上， 過氧化氫酶、蔗糖酶、脫氫酶活性隨連作年限而降低， 芳基硫酸酯酶與蛋白酶活性變化呈先下降后升高的特點， 說明綠洲棉田長期連作使部分土壤酶活性下降。

2.2 棉花連作對土壤微生物群落結構的影響

2.2.1 棉花連作對土壤細菌、真菌群落結構的影響

細菌和真菌是土壤中兩類最主要的微生物類群。聚類分析（UPGMA）結果表明， 在相似度為 75%情況下， CtN15 與 CtN5 各自聚為一類， 而 CtN10 與CtN5 的細菌群落多樣性相似度較為接近（圖 1A）。主成分分析（PCA）結果顯示， 土壤細菌群落的 2個主成分軸 PC1 和 PC2 分別代表總變量的 33.8%和 21.2%,累計方差貢獻率為 55.0%（圖 1B）。在第 1 主成分軸能把 CtN15 與 CtN5、CtN10 相區分， 而第 2 主成分軸區別不明顯。說明綠洲棉田連作不同年限改變了土壤細菌群落結構。真菌 DGGE 指紋圖譜聚類分析（UPGMA）表明， 不同處理可聚為兩類： CtN15單獨聚為一類， CtN5 與 CtN10 聚為一類， 兩類之間的相似度為 70%（圖 1C）。由圖 1D PCA 分析可知， 土壤真菌第 1 主成分（PC1）貢獻率是 31.7%, 第 2 主成分（PC2）貢獻率是 21.2%, 累計方差貢獻率為 52.9%.

在第 1主成分軸上， CtN15明顯區別于其他 2個處理；在第 2 主成分軸上， CtN10 有別于 CtN5 與 CtN15.聚類分析與 PCA 分析結果均表明， 新疆綠洲地區棉花長期連作對土壤真菌群落結構有明顯影響。

2.2.2 棉花連作對土壤鐮刀菌和枯草芽孢桿菌群落結構的影響

鐮刀菌是一類導致棉田發生病害的典型土傳病原微生物， 可引起棉花枯萎病?？莶菅挎邨U菌能產生多種微生物酶和抗菌物質， 常被用作生防菌， 對土傳病害具有顯著的拮抗作用。圖 2A、B 分別為土壤鐮刀菌和枯草芽孢桿菌的 DGGE 指紋圖譜。由DGGE 指紋印跡可知， 不同泳道條帶數越多說明微生物群落多樣性越豐富， 亮度越大密度越高， 說明群落中某一種群的數量越多。對不同連作年限土壤鐮刀菌和枯草芽孢桿菌群落結構 DGGE 指紋圖譜進行主成分（PCA）分析， 結果表明在相似度為 37%情況下， 土壤鐮刀菌的主成分（PC1 20.2%與 PC2 18.3%）可解釋總方差變異的 38.5%; 在相似度為 58%情況下， 土壤枯草芽孢桿菌的主成分（PC1 41.6%與 PC220.1%）可代表總方差變異的 61.7%.由圖 2C 可知，土壤鐮刀菌 3 個處理主要分成兩類， 在第 1 主成分軸 CtN10 顯著區別于 CtN5 和 CtN15, 在第 2 主成分軸上方差分異不明顯。土壤枯草芽孢桿菌變化趨勢與鐮刀菌相似， 但枯草芽孢桿菌對 3 種處理的響應更為敏感（圖 2D）。說明新疆綠洲棉田連作 5~15 年，土壤中病原菌、拮抗菌群落結構均發生明顯變化。

2.3 棉花連作對土壤微生物群落結構多樣性的影響

土壤微生物多樣性指數反映了群落中物種的豐富度及各種群間的均勻度分布狀況， 多樣性指數的高低表征微生物群落的復雜度和穩定性大小。由表3 可知， 細菌與真菌的條帶數、多樣性指數（Shannon-Wiener 指數和 Simpson 指數）均隨連作年限的增加而下降。15 年棉花連作真菌的條帶數和 Shannon-Wiener 多樣性指數分別比 5 年棉花連作處理低17.02%和 5.29%.土壤鐮刀菌與枯草芽孢桿菌的條帶數、多樣性指數隨棉花連作年限的增加表現出先下降后升高的特點。土壤枯草芽孢桿菌的條帶數、Shannon-Wiener 指數和 Simpson 指數表現為 CtN15處理分別比 CtN10 處理高 159.1%、54.8%、14.5%.

表明新疆綠洲棉田長期連作致使土壤主要微生物菌群多樣性發生變化。

3 討論與結論

長期連作使土壤有益菌種群結構隨連作年限降低， 病原菌種群結構則隨連作年限增加， 導致土壤微生物群落結構多樣性失衡。胡元森等發現作為拮抗菌的木霉（Trichoderma spp.）數量隨黃瓜（Cucumissativus）連作急劇下降 , 成為劣勢菌群 , 而鐮孢菌（Fusarium oxysporium）數量急劇上升為優勢菌群。谷巖等報道大豆連作真菌和細菌 PLFAs 比例顯著增加， 重迎茬使土壤活體微生物總量、土壤微生物量碳含量顯著降低， 說明大豆連作改變了土壤微生物群落結構。在本試驗中， 棉花連作 5~15 年使土壤細菌、真菌群落結構發生了明顯變化， 多樣性指數呈下降趨勢。究其原因可能是北疆棉花長期連作加之秸稈還田， 棉花根系分泌的某些化感物質抑制了細菌、真菌中某些種群的生物活性， 導致其多樣性水平降低。劉建國等對棉花不同連作與秸稈還田年限分析表明， 秸稈分解產生的化感物質所引起的自毒作用影響了土壤微生物的區系變化， 這為本文的推論提供了間接證據。

研究表明， 馬鈴薯根際鐮刀菌數量隨連作年限呈上升趨勢， 但不同菌種數量變化的趨勢各異.

Zhou 等研究發現， 長期連作黃瓜根際土壤尖孢鐮刀菌數量呈先降低后升高又降低的變化趨勢。本研究中棉田鐮刀菌多樣性先降低后升高， 之后并無再次降低的變化， 棉花連作 15 年鐮刀菌和枯草芽孢桿菌群落結構多樣性上升到一個新的水平， 并未導致棉田土壤微生物多樣性的持續下降。Berendsen 等認為土壤微生物在長期協同演化過程中， 致病菌占優勢的農田土壤能夠自主富集一種或多種對致病菌具有抑制作用的微生物， 長期連作不僅可為病原微生物的增殖提供充分的時間， 又為病原菌與拮抗菌提供協同演化的生活環境。聯系到新疆綠洲長期連作棉田， 可做如下推論， 即長期連作棉田的病原微生物種群數量與多樣性發展變化到一定程度后會引起其他微生物群落（拮抗菌）能夠自發調整其結構以適應外部環境， 這是土壤微生態系統中微生物群落結構的自組織和抗擾動作用的結果。Kinkel 等也提出土傳病害的病原菌與其他微生物及其土壤環境之間存在密切的協同演化。生物對環境中能量的獲取和利用機制， 尤其是針對不同物種 MEQ（microbiological energy quantum）的確立， 是生物與環境協同演化的結果.從微生物生態學原理分析，雖然土壤微生物種群數量及其多樣性對外界各種擾動具有自我調節能力， 但在自然條件下， 其調節的水平與進程尚遠未達到現代農業對作物低發病率和高產優質的要求。因此， 通過合理輪作或施用生物有機肥等是今后降低連作障礙， 構建“抑病型”健康土壤微生物區系的有效途徑。

土壤中各種酶是土壤微生物功能多樣性的承擔者， 尤其是抗逆性酶與土壤拮抗（致?。┚鷶盗看嬖跇O為密切的關系。如食莢菜豆根腐?。ˋphanomyceseuteiches）的抗病性與芳基硫酸酯酶活性呈正相關，并且能夠指示土壤真菌生物量.邢會琴等指出苜蓿（Medicago sativa）接種白粉病菌（Sphaerothecafuliginea）后， 葉片過氧化物酶（POD）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性均升高， 說明 POD 活性和 PAL 活性與苜蓿對白粉病的抗性顯著相關。蘇世鳴等運用磷脂脂肪酸（PLFA）法分析土壤微生物多樣性發現，西瓜單作的根際土壤中真菌數量較多， 細菌數量較少， 而且主要是革蘭氏陽性菌； 單作西瓜的保護性酶類如根系及葉片中的多酚氧化酶（PPO）、CAT、POD 和 PAL 活性均較高。本文蛋白酶和芳基硫酸酯酶活性變化與土壤中鐮刀菌、枯草芽孢桿菌對棉花長期連作的響應趨勢一致。將土壤鐮刀菌、枯草芽孢桿菌的條帶數與蛋白酶、芳基硫酸酯酶及過氧化氫酶活性進行皮爾遜（Pearson）相關性分析后發現，鐮刀菌的條帶數與芳基硫酸酯酶活性呈顯著正相關（r=0.79, P<0.05）； 與過氧化氫酶活性呈顯著負相關（r=-0.71, P<0.05）?？莶菅挎邨U菌的條帶數與芳基硫酸酯酶活性、蛋白酶活性相關系數分別為 0.85、0.86,表現出顯著正相關（P<0.01）； 與過氧化氫酶活性呈顯著負相關（r=-0.76, P<0.05）。說明北疆綠洲 15 年棉花連作土壤致病菌、拮抗菌與土壤抗逆性酶活性呈現出顯著相關關系。

綜上所述， 15 年棉花連作對北疆土壤酶活性和土壤致病菌、拮抗菌群落結構多樣性有明顯影響。

土壤酶活性隨連作年限增加而降低。細菌與真菌的多樣性指數（Shannon-Wiener 指數和 Simpson 指數）在 5~15 年連作中呈下降趨勢， 土壤鐮刀菌與枯草芽孢桿菌的條帶數、多樣性指數表現出隨棉花連作年限的增加呈先下降后升高的特點。長期連作對棉田土壤生物性狀有明顯負面影響。