近年來，獸藥抗生素作為抗細菌性疾病和促生長制劑，在集約化養殖中應用范圍不斷擴大，使用量逐年增加。據估計，我國每年抗生素原料生產量約 21 萬t,其中有 9.7 萬 （t46.1%）的抗生素用于畜牧養殖業，而四環素類抗生素在我國獸藥抗生素中生產和使用比例均為最大[1-2].而當四環素類抗生素藥物隨飼料進入動物消化道后，只有少部分代謝反應生成無活性的產物，有 30%~90%以原形通過糞便和尿液排出體外，對周圍環境和人體健康造成潛在的危害[3-4].四環素類抗生素是我國畜禽糞便中經常檢出的抗生素類群，不同研究人員在北京、山東、上海、浙江、江蘇、吉林、陜西、寧夏等全國不同地域的畜禽養殖場糞便中檢出四環素類[四環素（Tetracycline,TC）、土霉素（Oxytetra-cycline,OTC）和 金 霉 素（Chlortetracycline,CTC）] 殘留[5-7].目前研究結果表明，施用未處理糞便的土壤，土壤中抗性大腸菌群、抗性細菌和部分抗性基因的數量均有所升高，而對人和動物致病菌的抗性有可能通過細菌間基因橫向轉移而獲得[8-11].
好氧堆肥對糞便中四環素類抗生素殘留有較好的去除作用，而且不同的堆肥工藝對四環素去除也有影響。溫度、初始含水率、時間對豬糞中 TC、OTC 和CTC 生物降解均有影響[12].翻堆+機械通風能夠快速提高豬糞堆肥的堆體溫度，同時也能夠提高 OTC、CTC 等去除效果[13].添加微生物菌劑也能促進四環素類抗生素的降解，BM 菌劑（一種芽孢桿菌生物復合制劑）的添加能夠促進四環素類抗生素（TC、OTC、CTC）降解[14];添加纖維素降解菌能夠提高雞糞堆肥中CTC 和 OTC 的降解效果[15-17].目前研究多考察實驗室水平堆肥過程中糞便的四環素類抗生素殘留降解，針對抗性細菌的研究較少。本研究通過四環素抗性細菌選擇性計數方法，綜合考察了實際堆肥生產情況下，添加菌劑對雞糞堆肥過程中四環素類抗生素、致病菌及抗性細菌的影響。
1 材料與方法
1.1 堆肥原料及實驗方法
堆肥實驗于 2013 年 10 月至 2014 年 12 月在北京市懷柔區寶山有機肥廠進行。該廠以懷柔地區養雞場的雞糞為主要原料，并加入一定比例的羊糞或牛糞生產有機肥。本實驗完全按照該廠的生產方式進行。
將 12 m3雞糞和 6 m3羊糞混勻后，平均分成兩堆，體積為 3 m×2 m×1.5 m.實驗組（CA）接種自制菌劑（接種量為 0.3%），對照組（CK）不接種菌劑。待堆溫升至50 ℃后每隔 1 d 翻堆一次，進入二次腐熟期后停止翻堆。前 25 d 為一次堆肥期，第 25~50 d 為二次堆肥期，第 50~110 d 是儲藏期。自制菌劑主要菌種為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和地衣芽孢桿菌（Baclicuslincheniformis），兩種發酵液按 1∶1（V∶V）混合后，用草炭土進行吸附。原料混合后的基本性質見表 1.
1.2 樣品采集及檢測方法
在堆肥的第 1、8、17、47（二次堆肥）、110 d（儲藏期），分 3 點取樣各 500 g 后在勻質袋中混合均勻，在24 h 內檢測其總菌數及抗性細菌數，按四分法取樣100 g 于-80 ℃保藏用于抗生素檢測，剩余樣品風干后檢測其他各項指標。
采用便攜式溫度計測定堆體溫度，每次選取堆體的不同位置和深度共 5 個點測定并取平均值。采用烘干法測定物料含水率。用蒸餾水按 1∶10（W∶V）稀釋堆肥樣品，200 r·min-1條件下，搖床振蕩混勻 1 h,然后8000 r·min-1離心，取上清測定 pH 及電導率。有機質、總氮、磷、鉀和總養分的檢測方法參照有機肥料標準NY 525-2002.抗生素測定方法：取經冷凍干燥后的堆肥樣品0.5 g,經超聲萃取提取抗生素，通過固相萃取進一步純化樣品，后經超高壓液相色譜-質譜聯用儀（UPLC-MS/MS）檢測[7].色譜柱 ACQUITY UPLC BEH C18 柱（50×2.1 mm,1.7 μm），柱溫 40 ℃；樣品室溫度 10 ℃；樣品進樣體積 5 μL;流動相 A 為 0.1%甲酸水，流動相B 為甲醇（A∶B=90∶10），流速為 0.35 mL·min-1.質譜條件（表 2）：電噴霧電離離子源（ESI）；毛細管電壓 ESI+3.5 kV,ESI-3.0 kV;氮氣流量 700 L·h-1;霧化氣溫度400 ℃；離子源溫度 150 ℃；錐孔氣流速 30 L·h-1;碰撞氣流速 0.15 mL·min-1;掃描模式為多反應監測掃描模式（Multi reaction monitor,MRM）。在 1 g 糞便樣品中添加 100 μg·kg-1的混合標準溶液，每個添加樣取 4項目 四環素 TC/μg·kg-1土霉素 OTC/μg·kg-1有機碳 Org. C/% 全氮 TN/% 全磷 TP/%個平行，按上述方法，TC、OTC 和 CTC 的加標回收率分別為（110.8±9.97）、（81.9±8.63）、（97.5±6.75）μg·kg-1.
微生物計數方法：參照 GB 20287-2006,取新鮮堆肥樣品10 g 加入 100 mL 無菌水中，在旋轉式搖床上 200 r·min-1充分振蕩 30 min,靜置 20 min,用無菌移液器分別吸取 5 mL 上述母液，加入 45 mL 無菌水中，按 1∶10 進行系列稀釋，每個樣品取 3 個連續的適宜稀釋度，吸取不同稀釋度的懸液 0.1 mL,加入對應選擇培養基，并涂勻培養，每個梯度設兩個重復?？偩鷶担═otal Bacteria Counts,TBC）使用營養瓊脂培養基28 ℃培養 48 h,大腸菌群采用伊紅美蘭瓊脂（EMB）37 ℃培養 24 h,沙門氏菌采用硫酸鉍瓊脂 37 ℃培養24 h,四環素抗性菌計數分別在對應培養基中添加終濃度為 16 mg·L-1的 TC[18].
2 結果與討論
2.1 菌劑添加對堆體溫度變化影響
由于堆肥時間在秋冬季節，除起始 5 d 外，環境溫度在 10~15 ℃間小幅變動，堆肥前期由于降雨影響，使堆肥升溫過程有反復，實驗組在 10 d 內溫度上升到 60 ℃以上，并維持到第 23 d,第 25 d 后進入二次堆肥期，第 47 d 后溫度降低到 50 ℃以下（圖 1 未顯示）。在同樣的基質及實驗條件下，添加菌劑的實驗組溫度整體高于對照組（P<0.05），且其高溫期溫度也明顯高于對照，說明 0.3%的該型菌劑添加量能夠促進堆肥升溫及提高實際堆肥溫度。
2.2 堆體理化性質變化
堆肥過程中，物料理化性質的變化如表 3 所示。
肥料的含水率是考察堆肥腐熟程度的指標之一，本實驗中堆肥含水率隨著堆肥過程的延長而逐漸下降。由于實驗組堆體的溫度一直高于對照組，更有利于水份的蒸發，在整個高溫期含水率都略低于對照組。另一方面，由于家禽的消化道短，飼料中大量的蛋白質會未經充分的消化而排出體外，雞糞中蛋白質較牛糞和豬糞要高，以雞糞為原料的堆肥過程會在蛋白質降解過程中釋放氨，使堆體的 pH 升高。本實驗中由于菌劑中含有蛋白降解功能的芽孢桿菌，使實驗組的 pH較對照組變化大（5.86~8.66）。細菌總數整體的變化趨勢是隨著溫度的持續升高逐漸減小，至儲藏期后有緩慢的回升。2.3 四環素類抗生素降解規律**堆肥起始階段，原料中含有四環素和土霉素兩種抗生素，均未檢測到金霉素。隨著堆肥溫度的升高和時間的延長，兩種抗生素均呈現不同程度的降解（圖2）。四環素的降解在實驗組與對照組的區別不大，都在 17 d 后降解至檢測限以下。土霉素在實驗組的堆肥中降解效果明顯，從起始的 76 μg·kg-1,經過 47 d濃度降解至檢測限以下（13.3 μg·kg-1）。這與 OsmanArikan 等[19]在牛糞中添加稻草等輔料堆肥效果相類似，表明提高堆體溫度有利于土霉素的降解。而土霉素在對照組堆肥中降解效果并不明顯，至 110 d 仍保持在 70 μg·kg-1左右，與原料中的初始濃度無顯著性差異（P>0.05）。這與張樹清等[14]在雞糞堆肥中添加BM 菌劑（一種芽孢桿菌復合菌劑）的效果相似，該研究也證實四環素的降解率大于土霉素，且添加菌劑堆體的降解率也高于對照組，說明堆肥菌劑的添加有利于四環素和土霉素的降解。
2.4 致病菌消減
經檢測可知，堆肥原料雞糞中含有沙門氏菌（Salmonella）和大腸菌群（coliform），而且兩種病原菌中都含有一定比例的四環素抗性菌，原料雞糞中沙門氏菌為 5.4 lg CFU·g-1,抗四環素沙門氏菌為 4.52lg CFU·g-1,占總沙門氏菌的 16.7%（圖 3）。大腸菌群數量為 6.5 lg CFU·g-1,抗四環素的大腸菌群數量為6.16 lg CFU·g-1,占總大腸菌群的 45.46%（圖 4），與Cortney Mille 等[20]檢測美國有機肥中大腸菌群結果近似（1~6 lg CFU·g-1）。沙門氏菌無論在對照組還是實驗組，在堆肥第 8 d 就檢測不出，而大腸菌群能持續檢出，直到二次堆肥末期（第 47 d）。隨著堆肥進程，兩個堆體中四環素抗性的大腸菌群數量和相對比例均出現下降，說明堆肥高溫既能殺滅大腸菌群，也能消除四環素抗性的大腸菌群。
2.5 總菌數及四環素抗性細菌變化
總菌數的變化如圖 5 所示。堆肥初期，菌數隨著堆肥溫度升高而迅速減少，此時由于實驗組添加菌劑使堆溫高于對照組，微生物減少速度也高于對照組，與熒光定量 PCR 計算的堆肥未培養細菌的絕對數量變化結果相類似[21].經過二次堆肥后（第 47 d），實驗組菌數減少，而對照組菌數明顯增加，說明對照組中溫微生物利用高溫階段未降解的有機物迅速繁殖。在四環素抗性細菌方面，實驗組中四環素抗性細菌出現先下降再緩慢上升的趨勢（圖 6），而對照組四環素抗性細菌一直處于下降趨勢，兩者原料和成品肥料間的抗性細菌數量總體呈現下降趨勢（圖 7），分別相差1.41 lg CFU·g-1（實驗組）和 1.608 lg CFU·g-1（對照四環素抗性沙門氏組），而抗性菌所占比例分別為4.00%（實驗組）和1.17%（對照組），均高于原料的0.40%（實驗組）和0.39%（對照組）。雖然升溫有利于抗生素的消減，但含有四環素抗性細菌對高溫具有更好的耐受性，從而導致實驗組第19 c1時四環素抗性菌的比例得到明顯提高（（1.3%至9.6%），而高溫期過后，四環素抗性細菌競爭不過沒有抗性質粒的細菌，所以雖然抗性細菌的數量得到回升，但所占比例大幅下降（（4.0%）。
四環素抗性細菌的這種先升高再降低的現象，與Selvam等，“‘研究堆肥中四環素抗性基因變化規律類似。以上結果說明，堆肥成品與初始原料相比，其中的四環素抗性細菌比例呈增長趨勢，與廢水處理中出水與進水的四環素抗性細菌比例變化情況相類似}is畜禽養殖糞便堆肥化處理有利于消減養殖業對環境的抗生素污染，而四環素抗性基因在堆肥中變化規律有待進一步研究，并且因為有機肥最終由農田、果園等土壤所消納，所以有必要進一步研究四環素抗性細菌及其抗性基因在種植過程中的遷移規律。
3 結論
C1）菌劑的添加有利于堆肥升溫，并且能夠提高土霉素在堆肥中的降解效率、（2）經過二次堆肥能夠有效殺滅致病菌（沙門氏菌和大腸菌群，并且能夠消減四環素抗性的致病菌C3）堆肥處理能夠有效消減四環素抗性菌的絕對數量，添加菌劑可能導致后期抗性細菌數量的增長（4）堆肥過程中，抗性細菌比例呈現先增加后下降的趨勢，堆肥成品中的四環素抗性菌比例高于原料.
參考文獻：
[1] 王云鵬， 馬 越。 養殖業抗生素的使用及其潛在危害[J]. 中國抗生素雜志， 2008, 33（9）：519-522.WANG Yun-peng, MA Yue. Potential public hazard of using antibioticsin livestock industry[J]. Chinese Journal of Antibiotics, 2008, 33（9）：519-522.
[2] 王 瑞， 魏源送。 畜禽糞便中殘留四環素類抗生素和重金屬的污染特征及其控制[J]. 農業環境科學學報， 2013, 32（9）：1705-1719.WANG Rui, WEI Yuan-song. Pollution and control of tetracyclines andheavy metals residues in animal manure[J]. Journal of Agro-Environ-ment Science, 2013, 32（9）：1705-1719.
[3] Sarmah A, Meyer M, Boxall B. A global perspective on the use, sales,exposure pathways, occurrence, fate and effects of veterinary antibiotics（VAs）in the environment[J]. Chemosphere, 2006, 65（5）：725-759.
[4] Kemper N. Veterinary antibiotics in the aquatic and terrestrial environ -ment[J]. Ecological Indicators, 2008, 8（1）：1-13.
[5] 張樹清， 張夫道， 劉秀梅， 等。 規?；B殖畜禽糞主要有害成分測定分析研究[J]. 植物營養與肥料學報， 2005, 11（6）：822-829.
