溶磷菌在轉化土壤難溶磷、提高磷肥利用率、促進作物生長方面都具有顯著作用,而不同溶磷菌對不同形態難溶磷的溶解能力存在差異。溶解難溶性磷酸鹽的細菌主要有芽孢桿菌\\(Bacillus\\)、假單胞菌\\(Pseudomonas\\)、克雷伯氏菌\\(Klebsiella\\)、節桿菌\\(Arthrobacter\\)、沙雷氏菌\\(Serratia\\)、腸桿菌\\(Enterobacter\\)和伯克霍爾德氏菌 \\(Burkholde-ria\\)等,溶磷量最高可達643.2mg/L;而溶解有機磷的細菌主要有芽孢桿菌\\(Bacillus\\),溶磷量達到26.5mg/L。
溶磷菌溶磷機制各不相同,大部分溶磷菌以分泌物溶磷,其胞外分泌物中含有多種溶磷物質,近年來的研究主要集中在有機酸和磷酸酶方面。研究表明,大部分溶磷微生物的胞外分泌物中含有大量有機酸,所以一致認為有機酸是主要的溶磷物質;另外微生物生長繁殖過程中,分泌出酸性磷酸酶和堿性磷酸酶,這些磷酸酶能夠不斷地將環境中的有機磷轉化為無機磷。蛋白質、多糖、氨基酸等物質在環境中可能會溶解難溶磷,這些物質可能也與溶磷菌的溶磷效果有關,但目前此方面研究較少。為此,本研究從生活垃圾堆積地采集土樣,篩選兼具高效利用磷酸鈣和卵磷脂功能的細菌菌株,并測定其在不同磷源培養下胞外分泌物中的有機酸、蛋白質、多糖、氨基酸含量及酸性磷酸酶活性,以期為高效溶磷菌的篩選及其溶磷機制研究奠定基礎。
1 材料和方法
1.1 土樣
供試土樣取自生活垃圾堆積地非根際土壤。
1.2 難溶磷培養基
葡萄糖10.0g、\\(NH4\\)2SO40.5g、NaCl 0.3g、KCl 0.3g、MgSO4·7H2O 0.3g、FeSO4·7H2O0.03g、MnSO41.0g、Ca3\\(PO4\\)25.0g或卵磷脂2.0g、無菌水1L,pH值7.0~7.5。
1.3 溶磷菌的篩選和溶磷能力的測定
將采集的土樣用稀釋平板法涂布于難溶磷卵磷脂培養基上,30 ℃培養5d,挑選周圍產生明顯透明圈的單菌落劃線純化后保存于LB固體斜面培養基上。用滅過菌的牙簽將篩選出的菌株分別點接在2種難溶磷固體培養基上,30 ℃培養5d,挑選在2種難溶磷固體平板上均能產生明顯透明圈的單菌落,并測量溶磷圈直徑\\(D\\)和菌落直徑\\(d\\)。挑選D/d或D值較大的菌株,按1%接種量分別接入2種難溶磷液體培養基中,搖床培養6d\\(30 ℃、150r/min\\)。發酵液經10 000r/min離心10min,用鉬銻抗比色法測定上清中可溶性磷含量,選擇溶磷量最大的菌株進行鑒定。
1.4 溶磷菌的鑒定
1.4.1 生理生化鑒定參照文獻[12]對溶磷菌分別進行生長溫度試驗、接觸酶試驗、苯丙氨酸脫氨酶試驗、明膠液化試驗、淀粉水解試驗、V-P試驗、檸檬酸鹽利用試驗、糖醇類發酵試驗、厭氧生長試驗。
1.4.2 16SrDNA分析采用DNA快速提取試劑盒\\(北京艾德萊生物科技有限公司\\)提取細菌基因組DNA,利 用16S rDNA通 用 引 物 \\(P1:5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′;P2:5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′\\)進行PCR擴增。PCR反應條件:95 ℃ 5min;30個循環\\(94℃1min,55℃1min,72℃2min\\);72℃10min。擴增產物經PCR產物純化試劑盒\\(北京賽百盛基因技術有限公司\\)回收,連接pSURE-T載體后測序。
利用Blast將測序結果與GenBank數據庫中的已知序列進行比對分析,采用Mega 5.05軟件以鄰接\\(Neighbor-Joining\\)法構建系統發育樹。
1.5 溶磷菌胞外分泌物中溶磷物質含量及活性測定將活化好的菌株按1%接種量分別接種于以磷酸鈣、卵磷脂、磷酸氫二鉀\\(對照\\)為唯一磷源的液體培養基中,30℃振蕩培養,分別于第2、4、6天取培養液以8 000r/min離心10min,每個處理設3個重復。分別利用酸堿滴定法、茚三酮顯色法、蒽酮 法、DNS法及 考 馬 斯 亮 藍G250染 色法測定上清液中的有機酸、氨基酸、總糖、單糖及蛋白質含量,利用對硝基苯磷酸二鈉法測定上清液中酸性磷酸酶的活性。
2 結果與分析
2.1 溶磷菌株的分離、篩選初篩出32個可以溶解卵磷脂的菌株。將這些菌株點接于2種難溶磷固體平板上,有10株菌株在平板上形成明顯透明圈,說明這10株菌株都具有降解卵磷脂和磷酸鈣的能力。其中,菌株LY4、LY8、LY12、LY25在卵磷脂培養基上的D/d值較大,均大于3.0;LY7、LY8、LY10、LY25在磷酸鈣培養基上的D/d值較大,均大于2.0。
2.2 溶磷菌溶磷能力分析綜合 考 慮D、D/d值,挑 選 菌 株LY4、LY7、LY8、LY10、LY12、L25進行液體搖瓶復篩試驗,以確定不同菌株對不同難溶磷源的溶解能力。由表1可知,對于卵磷脂,LY4的溶磷量最大,達到28.2mg/L;LY8次之,為26.6mg/L。對于磷酸鈣,LY8的溶磷量最大,達到647.8mg/L;LY10次之,為625.4mg/L。綜合考慮對卵磷脂和磷酸鈣的溶解能力,選擇LY8菌株進行后續試驗?！颈?】
2.3 菌株LY8的初步鑒定菌株LY8能在5~40℃條件下生長,接觸酶和苯丙氨酸脫氨酶試驗為陽性,能水解明膠、淀粉,V-P試驗為陰性,能利用檸檬酸鹽,可利用D-葡萄糖、D-甘露醇、L-阿拉伯糖產酸,在糖類中生長不產氣,厭氧環境下不能生長。
菌株LY8的16SrDNA序列長度為1 560bp,利用Blast進行序列比對發現,其與Bacillus ar-yabhattai\\(HF570067.1\\)、Bacillus megaterium\\(AB334764.1\\)和Bacillus subtilis\\(EU257453.1\\)的同源性均達到99%。將其中與菌株LY8相似性較高的9種菌構建系統發育樹\\(圖1\\)。根據系統發育樹,結 合菌株 的形態和生理生化 特征,初步確定LY8為巨大芽孢桿菌\\(Bacillus megaterium\\)。
2.4 菌株LY8胞外分泌物中的溶磷物質分析
2.4.1 有機酸有機酸是一類酸性有機化合物,能夠解離出游離的H+,H+與PO3-4結合形成可溶性H2PO-4和HPO2-4鹽,同時有機酸根離子能夠與Fe3+、Al3+、Ca2+結合從而釋放無機磷。由圖2可以看出,貧磷條件下發酵液中有機酸質量濃度遠遠大于 富磷條件,尤其是在 磷酸鈣 條 件下,這 與伊鋆的研究結果一致。隨培養時間的延長,有機酸質量濃度微弱增加。其中,以磷酸鈣為磷源時,發酵液中有機酸質量濃度最大可達到34.3g/L;以卵磷脂為磷源時,發酵液中有機酸質量濃度有所下降,最大達到11.2g/L。說明有機酸是菌株LY8的溶磷物質,尤其是溶解磷酸鈣的主要物質。
2.4.2 酸性磷酸酶磷酸酶可水解有機磷化合物釋放出無機磷。在貧磷條件下,酸性磷酸酶活性明顯提高\\(圖3\\)。其中,以卵磷脂為磷源時,發酵液中酸性磷酸酶活性最高達4 100mol/\\(g·h\\);而以磷酸鈣為磷源時,發酵液中酸性磷酸酶活性稍有下降,最高為2 760mol/\\(g·h\\)。所以,酸性磷酸酶是菌株LY8的溶磷物質,尤其是溶解卵磷脂的主要物質。而鐘傳青等研究發現,與可溶性磷和無機難溶磷相比,P4和Y3菌株在溶解有機磷時,發酵液中磷酸酶活性較低,與本研究結果不一致。所以,酸性磷酸酶可能不是所有溶磷菌株溶解有機磷必須的物質。另外,由圖3可知,酸性磷酸酶活性在LY8菌株培養2d后即達到最大,且隨著培養時間的延長,其活性明顯下降,這可能是因為酶的活性受培養溫度等條件的影響,所以磷酸酶的酶解作用主要發生在溶磷菌溶磷初期。
2.4.3 多糖由圖4可知,3種磷源條件下,菌株LY8均可分泌一定數量的多糖,但以卵磷脂為磷源時,發酵液中多糖質量濃度明顯高于其他2種磷源,最高 達 到160.0 mg/L,說 明 多 糖 可 能 也 是 菌 株LY8溶解卵磷脂的重要物質。
2.4.4 蛋白質由圖5可以看出,3種磷源條件下,菌株均可分泌一定數量的蛋白質,且隨著培養時間的延長,蛋白質質量濃度逐漸下降。其中,以卵磷脂為磷源時,培養液中蛋白質質量濃度明顯高于其他2種磷源,最高達到47.8mg/L,說明蛋白質可能也是菌株LY8溶解卵磷脂的重要物質。
2.4.5 氨基酸 Liba等研究固氮細菌溶磷時發現,溶磷的主要分泌物為氨基酸。而本研究結果表明,3種磷源條件下,菌株均能分泌一定數量的氨基酸,且沒有明顯差異\\(圖6\\),說明氨基酸與菌株LY8的溶磷能力關系不大。
3 結論
通過初篩和復篩得到1株高效兼溶無機磷\\(磷酸鈣\\)和有機磷\\(卵磷脂\\)的溶磷菌LY8,其在2種難溶磷液體培養基中培養6d后水溶性磷含量分別達到647.8mg/L和26.6mg/L。結合生理生化試驗并經過16SrDNA序列分析,初步確定LY8為巨大芽孢桿菌\\(Bacillus megaterium\\)。
貧磷條件促進LY8菌株分泌有機酸、蛋白質、多糖和酸性磷酸酶,但在不同難溶磷源條件下其分泌的主要溶磷物質不同。對于無機難溶磷磷酸鈣,LY8菌株分泌的主要溶磷物質是有機酸,其次是磷酸酶;而對于有機難溶磷卵磷脂,LY8菌株分泌的主要溶磷物質是磷酸酶,另外其分泌的有機酸、蛋白質和多糖可能也具有一定的溶磷效果,但蛋白質和多糖是缺磷脅迫誘導溶磷菌產生的,還是溶磷過程中所必需的物質,需要進一步研究。
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