梨 Pyrus 是世界范圍栽培的主要果樹樹種之一。 2012 年中國梨的栽種面積為 108.55 萬 hm2， 梨產量達到了 1 579 萬 t［1］， 為世界上梨產量最高、 面積最大的國家。 梨為落葉喬木， 樹體較大， 而且結果周期較長， 因此， 梨的新品種選育不僅需要的時間長， 而且土地及勞動力投入耗費大。 目前， 中國梨品種選育方式主要包括雜交育種、 芽變選種、 實生選種、 輻射育種等［2］。 以上梨品種培育方法中除了輻射育種， 其他育種方式的效率都較低， 難以滿足育種和生產實踐的需求。 此外， 由于梨自身產生突變的效率比較低， 難以獲得類似模式植物的突變體材料用于重要性狀的內在機制研究， 因此， 開展梨突變體的創制具有重要的實踐和科學意義， 是十分重要的研究工作。 甲基磺酸乙酯（EMS）是目前應用最為廣泛， 效果最佳的化學誘變劑之一， 其誘變后代的突變頻率高， EMS 處理玉米 Zea mays 花粉， 突變頻率高達 78%［3］， 且多為顯性突變［4］， 易于突變體的篩選。 EMS 已成功應用于水稻 Oryza sativa， 油菜 Brassi-ca napus 等 10 多種植物誘導突變體［5－15］， 但在梨上的應用還未見報道。 為了探索適宜梨的突變體誘導技術體系， 本研究采用不同體積分數的 EMS 溶液處理杜梨 Pyrus betulaefolia 種子， 通過對種子萌發、 遺傳位點變異率鑒定， 以及幼苗生長發育狀態等檢測， 篩選最適宜的 EMS 誘變處理體積分數， 以期獲得梨的突變體， 為梨新品種的選育以及特異性狀分子基礎研究提供資源和種質材料。
1 材料與方法
1.1 材料
供試材料為杜梨種子， 采集于南京農業大學國家梨工程研究中心江浦實驗基地。 EMS 藥劑由美國Sigma 公司生產。
1.2 誘變材料的準備
使用砂藏法層積 2 000 粒杜梨種子， 溫度為 4 ℃， 濕度為 60%， 層積時間為 40 d， 在發現種子有80%左右尖端露白時即可使用 EMS 藥劑進行處理 。 處理前先用蒸餾水將河沙洗凈 ， 再用蒸餾水浸泡24 h。
1.3 EMS 處理
將杜梨種子隨機分成 10 組， 200 ?！そM－1， 放入錐形瓶中。 使用 0.1 mol·L－1， pH 7.0 的磷酸緩沖液配置 EMS 溶液， 各組 EMS 的體積分數依次為 0 （ck）， 0.1%， 0.2%， 0.3%， 0.4%， 0.5%， 0.6%， 0.7%，0.8%和 0.9%。 將配置好的 EMS 溶液分別加入各組， 將錐形瓶口封住， 搖勻， 處理 24 h 后使用硫代硫酸鈉清洗種子 15 min， 再用雙蒸水清洗 15 min， 將種子晾干后， 播種， 種子出芽時統計出芽率。
1.4 基因組 DNA 的提取
隨機選取梨苗 20 株·組－1， 于春季采集幼嫩葉片， 液氮速凍后保存于－70 ℃。 使用改良的十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取 DNA［16］， 在 10.0 g·kg－1瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測 DNA 質量， 使用 Nan-odrop 超微量分光光度計調整質量濃度至 50 mg·L－1， DNA 樣品保存于－20 ℃。
1.5 SRAP 標記檢測遺傳變異頻率
從通用的相關序列擴增多態性（sequence-related amplified polymorphism， SRAP）引物中篩選出多態性較好， 條帶較為清晰的 10 對引物［16］， 并對它們進行編號（表 1）， 檢測 EMS 處理后杜梨幼苗的遺傳變異頻率， 并進行重復驗證。 聚合酶鏈式反應（PCR）體系（25.0 μL）： 10×PCR 緩沖液（Mg2+） 2.0 μL， 2.5mmol·L－1dNTP 1.6 μL， 各引物 0.6 μL， 50～100 ng DNA 模板， Taq 酶 1.0×16.67 nkat（藥劑購于 TakaRa公司）。 PCR 擴增所用程序： 94 ℃預變性 4 min， 94 ℃， 1 min， 35 ℃， 1 min， 72 ℃， 1 min， 5 個循環， 94 ℃變性 1 min， 55 ℃退火 1 min， 72 ℃ 1 min， 34 個循環后 72 ℃延伸 8 min， 應用 SensoquestLabcycle PCR 儀器進行擴增。
取 PCR 產物 1.5 uL 點樣于質量濃度為 0.8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離， 以恒定功率 80W， 電泳 2.5 h， 染色液染色 15 min， 顯色液顯色 15 min 后拍照記錄。 觀察電泳圖譜， 將各對引物變異位點處有條帶的記為 “0”， 無條帶的記為 “1”， 將數據錄入 Excel 表格中， 計算變異條帶總數和變異平均值。
1.6 幼苗的田間生長情況調查統計
幼苗定植田間后， 定期管理幼苗， 分別于 2012 年 12 月和 2013 年 12 月， 測量所有梨苗的植株高度和節間長度， 計算各組植株高度均值和平均節間長度， 并進行差異顯著性分析。
2 結果與分析
2.1 不同體積分數 EMS 處理對杜梨種子發芽率的影響
統計各組 EMS 處理后杜梨幼苗發芽率， 結果顯示： 不同體積分數 EMS 處理降低了梨苗的發芽率。
各組中， 發芽率最高的組為對照組， 其發芽率為 90.5%； 發芽率最低的組為第 10 組（體積分數為 0.9%EMS）， 發芽率僅為 15.5%。 從表 2 中可以看出： 在 EMS 體積分數為 0.1%~0.6%時， 隨著體積分數升高，發芽率逐漸降低； 而在 EMS 體積分數為 0.7%和 0.8%時， 發芽率趨于平穩； 半致死劑量出現在 EMS 體積分數為 0.3%處理組樣品， 該組出芽率為 47.0%； 臨界致死劑量出現在 EMS 體積分數為 0.4%處理組樣品， 該組出芽率為 38.0%。
2.2 SRAP 標記鑒定杜梨幼苗的 DNA 變異
利用篩選的 10 對 SRAP 標記通用引物對不同處理組的樣本 DNA 進行鑒定， 統計各組幼苗的變異頻率。 結果表明： 10 對引物總共檢測到 15 個變異位點， 平均每對 1.5 個， 變異位點多出現在 100~500 bp擴增大小區間。 數據統計結果顯示， EMS 的體積分數為 0.4%時， 變異頻率最高， 為 37.3%（表 2）。 可見， EMS 處理梨種子使其產生了可鑒定的序列位點突變。 如圖 1 所示： 為引物 em10-me5 檢測對照組與0.4% EMS 處理組隨機選取的 20 株幼苗的遺傳突變擴增圖譜， 可見 0.4%EMS 處理組在 100~250 bp 間產生了突變位點。 通過引物擴增的重復試驗， 可以確定檢測到的變異位點是穩定可靠的。
2.3 誘變植株的田間生長測量與分析
不同體積分數 EMS 處理后的幼苗定植田間后， 定期管理幼苗， 測量杜梨苗第 1 年和第 2 年停止生長時的植株高度和節間長度， 并計算各組植株高度均值的差異顯著性以及平均節間長度（表 3）。 統計結果顯示： 杜梨苗第 1 年和第 2 年停止生長時， 植物高度均值最高的組都為對照組， 其高度分別為 81.9cm 和 175.5 cm； 植物高度均值最低組則發生了變化， 第 1 年停止生長時最低組為第 4 組， EMS 體積分數為 0.3%， 其高度為 44.5 cm， 而第 2 年時， 最低組為第 8 組， EMS 體積分數為 0.7%， 其高度為 92.0cm； 杜梨苗第 1 年和第 2 年停止生長時， 各組株高均與對照組差異極顯著（P＜0.01）， 可見 EMS 處理梨種子后都在一定程度上影響了梨苗的生長。 平均節間長度數據的統計結果顯示： 杜梨連續 2 a 停止生長時， 對照組的節間長度都是最長的， 分別為 1.97 cm 和 3.10 cm。 第 1 年停止生長時最短組為第 6 組
EMS 體積分數為 0.5%， 其長度為 1.68 cm。 第 2 年時， 最短組為第 5 組， EMS 體積分數為 0.4%， 其長度為 2.56 cm； 第 1 年停止生長時， EMS 處理各組的梨苗節間長度差異不顯著； 第 2 年停止生長時， 對照組與第 2， 4， 5， 7， 8， 9 組差異極顯著（P＜0.01）。
2.4 EMS 處理促進杜梨種子突變的最佳體積分數
誘變育種中一般采用植株半致死劑量或臨界劑量作為誘變的最佳體積分數［17］。 杜梨苗的半致死劑量出現在第 4 組， EMS 處理體積分數為 0.3%； 臨界劑量出現在第 5 組， EMS 體積分數為 0.4%。 經過SRAP 分子標記檢測， 變異頻率最高的組為第 5 組， EMS 處理體積分數正好為臨界劑量。 在表型數據上， 雖然第 4 組的梨苗高度低于第 5 組， 但 2 組之間的差異并不顯著； 而在節間長度方面， 2 組的長度較為接近。 因此， 綜合以上數據分析， 確定 EMS 處理促進杜梨種子突變的最佳體積分數為 0.4%。
3 討論
3.1 EMS 誘變植物產生不同類型的突變
EMS 是一種良好的化學誘變劑， Klmark于 1953 年最早報告了 EMS 對突變誘導的有效性。 其后 EMS被廣泛應用于植物中， 其產生的突變類型較多。 例如抗逆類型突變， Zhou 等［5］使用 EMS 誘變水稻， 獲得了抗鹽性的突變植株； 品質和產量類型突變， Fang 等［8］使用 EMS 誘變花生 Arachis hypogaea， 獲得高油酸突變體； 形態特征類型的突變， 這類突變是 EMS 誘變后突變最多的類型， 而且大致上都是以矮化為主， EMS 在許多植物［6－14］上都產生了不同程度的矮化突變體。 本實驗中， 使用不同體積分數的 EMS 誘變杜梨種子后， 不僅產生了可檢測的遺傳變異， 各處理組在株高上顯著低于對照組， 形態上發生了變化， 但要確定這些變異是否為可遺傳的穩定變異， 還有待于進一步試驗研究。
3.2 EMS 誘變植物的最佳體積分數
不同體積分數 EMS 誘變植物產生突變體效率不同。 Fang 等［8］使用 10.0 g·kg-1的 EMS 處理原本油酸含量 44.2%的花生品種， 得到了油酸含量超過 60%的突變體。 而 Zhou 等［5］使用體積分數為 0.5%的 EMS處理水稻種子， 獲得了抗鹽性較好的突變體。 我們使用不同體積分數的 EMS 處理杜梨種子， 結合分子和生理指標的鑒定， 獲得了促進杜梨突變的最適宜 EMS 體積分數為 0.4%。 由此可見， EMS 處理在不同物種的最佳使用體積分數是有差異的， 需要針對不同物種進行優化和篩選。
3.3 EMS 誘變的分子標記鑒定
EMS 是一種烷化劑， 能夠誘發基因突變， 多為點突變［4］， 使用 DNA 分子標記的方法可以快速有效地鑒定出突變位點。 胡建斌等［18］使用 SRAP 分子標記技術檢測到了 EMS 誘變黃瓜 Cucumis sativus 的變異位點。 殷冬梅等［19］使用隨機擴增多態性 DNA（RAPD）分子標記技術檢測到了 EMS 誘變花生的突變位點。 相比于其他分子標記， SRAP 分子標記的特點： 操作較為簡單， 只涉及到 PCR 擴增； 引物片段較長， 重復性較好； 使用通用引物， 正反向引物可以隨機組合； 檢測結果中共顯性標記占標記位點的比例較高［20－21］， 在基因組中分布較為均勻， 更適用于檢測農藝性狀的差異［22］。 本試驗中， 使用的 10 對通用SRAP 引物共檢測到了 15 個突變位點， 檢測效率較高， 可對篩選適宜的 EMS 體積分數提供可靠的數據支持。
3.4 EMS 矮化分子育種中起到重要作用
EMS 在農作物與蔬菜花卉中的應用較廣 ， 已構建了很多突變體庫 。 由于木本植物生長周期較長，獲得穩定遺傳的時間較長， 所以在果樹上的應用研究還比較少。 本研究中， 我們首次使用不同體積分數的 EMS 藥劑誘變杜梨種子， 通過分子和生理數據的鑒定與分析， 得到了最佳的誘變處理體積分數， 其種子繁殖當代植株在形態上表現出了一定的變異特征， 相比于傳統的雜交育種和自然突變體篩選， 化學誘變的效率更高。 本研究結果將為今后快速獲得梨突變體提供可靠的理論基礎和依據。
參考文獻：
［1］ 中華人民共和國農業部. 中國農業年鑒 2012［M］. 沈陽： 遼寧教育出版社， 2012： 214 － 215.
［2］ 柴明良， 沈德緒. 中國梨育種的回顧和展望［J］. 果樹學報， 2003， 20（5）： 379 － 383.
