西芹\\(ApiumgraveolensL.\\)為傘形科植物。醫學家認為,西芹始于藥用,具有降血壓、健胃、利尿、潤肺等功效,后來把它用作辛香蔬菜。
其含有大量的黃酮類化合物,黃酮類化合物的生理活性多種多樣,具有降低血管脆性及異常的通透性、降血脂、降血壓、抑制血小板聚集及血栓形成、抗氧化、抗菌、抗病毒等作用,而其中最具有代表性的黃酮類化合物西芹素\\(苷\\)具有預防腫瘤發生的生物活性而備受關注。
本實驗采用超聲波法提取西芹中的總黃酮類物質,旨在探討西芹中總黃酮的最佳提取工藝,為西芹的質量評價及在西芹進一步的研究過程中正確選擇原料及其綜合開發提供科學依據。
1、原料、儀器與試劑
1.1原料
試驗藥材:西芹莖葉,采于青海省樂都縣。
1.2儀器
FA1064N型電子天平\\(上海精密儀器儀表有限公司\\);TU-1810紫外可見分光光度計\\(北京普析通用儀器有限責任公司\\);KQ-300B型超聲波清洗器\\(昆山市超聲儀器有限公司\\);DFY-200C粉碎機\\(上海谷寧實業有限公司\\);60目篩網。
1.3試劑
95%乙醇\\(AR\\)、氫氧化鈉\\(AR\\)、亞硝酸鈉\\(AR\\)、硝酸鋁\\(AR\\)、蘆丁標準品;實驗用水為蒸餾水。
2、實驗方法與結果
2.1樣品的處理
取西芹莖葉,切斷,烘干,粉碎后過60目篩作為實驗樣品備用。
2.2樣品溶液的制備
準確稱取1.0000g西芹莖葉混合粉末,用60%乙醇20ml超聲提取30min,過濾取其濾液,即得待測溶液。
2.3紫外分光光度法測定西芹總黃酮顯色方法
精密吸取1.0ml樣品溶液至25ml容量瓶中,加95%乙醇5ml,加入5%亞硝酸鈉溶液1ml,搖勻,6min后加入10%硝酸鋁溶液1ml,搖勻,6min后加入10%氫氧化鈉溶液5ml,95%乙醇定容。隨行做空白對照。
2.4最大吸收波長的確定
取上述樣品溶液,在全波長范圍內掃描溶液的紫外吸收光譜,該溶液在510nm處有最大吸收值,因此本實驗選擇510nm作為檢測波長。
2.5對照品蘆丁標準溶液的制備
精密稱取蘆丁標準樣品0.0101g,至25ml容量瓶中,用95%乙醇溶解并稀釋至刻度,即得蘆丁對照品標準溶液。
2.6標準曲線的繪制
精密吸取蘆丁標準溶液0.0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0ml分別置于25ml容量瓶中,按2.3項方法,分別在510nm處測定其吸光度。結果見表1。
根據上表數據,以吸光度A為縱坐標,以蘆丁標準溶液的濃度C\\(mg/ml\\)為橫坐標繪制標準曲線,見圖1。得到蘆丁濃度C與吸光度A關系曲線,其線性回歸方程式為:y=8.1259x+0.0023,相關系數R2=0.9996。
2.7供試品溶液總黃酮含量的測定方法
精密稱取西芹莖葉混合粉末1.0000g,用60%乙醇20ml超聲提取30min。按照2.3項下的方法將提取后的溶液進行處理,測定吸光度。根據公式X=\\(A-0.0023\\)/8.1259×25×20/1000計算出樣品的總黃酮濃度。
3、超聲波提取法的單因素實驗及結果
影響超聲波提取法提取效率的因素主要有:提取劑濃度\\(乙醇濃度\\),提取次數,提取時間及料液比4個因素。本單因素實驗主要通過考察上述4個因素來判斷它們對于提取率的影響。
從而選出每個單因素下的最優條件,為進一步正交實驗奠定基礎。
3.1提取劑濃度對總黃酮收率的影響
精密稱取西芹莖葉混合粉末1.0000g各5份,分別置于250ml錐形瓶中,各自按照料液比1∶20分別加入40%,50%,60%,75%和90%乙醇,超聲提取時間為30min。根據2.3項下的方法將提取后的溶液進行處理,制備供試品溶液,分別在510nm下測出吸光度,以乙醇濃度為橫坐標,以吸光度A為縱坐標作圖,見圖2,測定結果見表2。
實驗結果表明,50%乙醇提取效果最好,往后隨著乙醇濃度加大,總黃酮含量開始下降?？赡苁请S著乙醇濃度增加,某些脂溶性雜質溶出量增加,干擾因素增多所致。因此應該選擇50%左右的乙醇作為西芹莖葉總黃酮提取溶劑。
3.2料液比對總黃酮收率的影響
精密稱取粉碎好的西芹莖葉混合原料1.0000g5份,分別置于錐形瓶中,按照料液比1∶10,1∶15,1∶20,1∶25和1∶30,加入50%乙醇,超聲提取時間30min。根據2.3項下的方法將提取后的成分進行處理,制備供試品溶液,分別在510nm下測定吸光度,以料液比為橫坐標,吸光度A為縱坐標,見圖3,測定結果見表3。
實驗結果表明,料液比1∶20提取效果最好,隨著料液比加大,總黃酮含量開始下降?？赡苁请S著料液比增加,某些雜質的溶出量增加,干擾因素增多所致。因此應該選擇1∶20左右料液比作為西芹總黃酮提取溶劑體積。
3.3提取時間對總黃酮收率的影響
精密稱取西芹莖葉混合原料1.0000g5份,分別置于錐形瓶中,按照料液比1∶20依次加入50%乙醇,按照提取時間30min,40min,50min,60min,70min進行超聲提取。根據2.3項下的方法將提取后的成分進行處理,制備供試品溶液,分別在510nm下測出吸光度,以提取時間為橫坐標,吸光度A為縱坐標,見圖4,測定結果見表4。
實驗結果表明,提取時間為50min,提取效果最好,隨著提取時間增加,總黃酮含量開始下降?？赡苁请S著提取時間的增加,某些黃酮成分被破壞所致。因此選擇50min作為西芹中總黃酮提取時間。
3.4提取次數對總黃酮收率的影響
精密稱取西芹莖葉混合原料粉末1.0000g各4份,分別置于錐形瓶中,按照料液比1∶20依次加入50%乙醇,提取時間均設定為50min。分別按照提取次數1次,2次,3次,4次進行超聲提取,分別合并提取液。根據2.3項下的方法進行處理,制備供試品溶液,分別在510nm下測定吸光度,以提取次數為橫坐標,吸光度A為縱坐標,見圖5,測定結果見表5。
實驗結果表明,隨著提取次數增加,總黃酮含量升高,但提取3次后,含量變化曲線已較為平緩?？紤]到生產工藝對時間的要求和溶劑的損耗,提取次數以3次以內為宜,故本實驗選取提取3次為總黃酮含量的提取次數。
3.5正交實驗確定各單因素之間相互影響的大小以上討論了各單因素影響,根據每種單因素的最佳條件,為每個單因素設定提取的最佳范圍,即當提取劑為50%乙醇,料液比為1∶20,提取時間為50min,提取次數為3次時,提取效果最好。但在實際操作中,各因素之間相互交叉影響。因此,為了全面考察影響因素,選擇L9\\(34\\)正交表,以乙醇濃度,料液比,提取時間和提取次數為4因素,做3水平正交實驗,正交實驗因素水平表見表6。正交實驗結果見表7。方差分析結果見表8。
實驗結果表明,由表8可知,影響西芹總黃酮提取的主次因素順序為D>C>A>B,即提取次數>料液比>乙醇濃度>提取時間。由表7可知,西芹總黃酮含量最高為2.65%。西芹總黃酮含量最佳提取工藝為A1B2C2D3,即45%乙醇、每次提取50min、料液比1∶20、提取3次。
4、討論
本論文主要通過乙醇超聲波提取法提取西芹總黃酮,通過單因素實驗,篩選出了單因素最佳提取條件。并利用正交設計試驗,研究了西芹總黃酮化合物最佳提取工藝。該工藝操作簡便,結果可靠,為進一步研究西芹提供了科學依據。
參考文獻:
〔1〕王克勤,陳靜萍,羅欣武,等.HPTLC法測定芹菜提取物中芹菜素的含量〔J〕.核農學報,2008,22\\(1\\):65-69.
〔2〕江蘇新醫學院.中藥大詞典〔M〕.上海:上?？茖W技術出版社,1995:1595-1596.
〔3〕李民,甘卉芳,吳坤.芹汁對四氯化碳致肝臟脂質過氧化的保護作用〔J〕.衛生毒理學雜志,1996,10\\(4\\):220-227.
〔4〕應森林,李彥.芹菜的藥理研究和應用〔J〕.天津中醫學院學報,2000,19\\(4\\):45-46.
〔5〕劉仲則.中草藥黃酮類化合物心血管活性成分概述〔J〕.中草藥,1987,18\\(3\\):37-60.
〔6〕楊立紅.芹菜葉柄與葉片中總黃酮含量的研究〔J〕.山東師范大學學報:自然科學版,1998,13\\(4\\):434-436.
〔7〕嚴建剛,張名位,楊公明,等.芹菜黃酮的提取條件及其抗氧化活性研究〔J〕.西北農林科技大學學報:自然科學版,2005,33\\(1\\):131-135.
〔8〕陳健初,董紹華,葉興乾,等.芹菜黃酮及其在主要制汁過程中的變化〔J〕.浙江農業大學學報,1998,24\\(3\\):279-282.
