水楊酸\\(salicylic acid,SA\\)是植物體內普遍存在的一種酚類化合物,是細胞內信號分子,又是一種內源性激素[1],參與調節植物的許多生理過程。研究發現,SA具有誘導植物系統抗病性[2],提高植物對非生物逆境的抗性,如緩解重金屬對植物的毒害作用[1],提高植物抗鹽性[3-5]、加快種子萌發速率[4-7]等。但目前關于這方面的研究報道多見于玉米\\(Zea mays\\)[1]、小麥\\(Triticum aestivum\\)[4]和水稻\\(Oryza sativa\\)[7]等大田作物,而涉及蔬菜作物形態建成的較少。
花椰菜\\(Brassica oleracea var.botrytis\\)又名花菜、菜花、球花甘藍,為十字花科\\(Cruciferae\\)蕓薹屬\\(Brassi-ca\\)植物。其營養豐富,質地細嫩,風味鮮美而廣受人們喜愛,已成為我國重要的蔬菜作物,也是蘭州市高原夏菜主栽蔬菜之一,近年發展規模越來越大,然而栽培常受到鹽漬地威脅,給生產造成不同程度的損失[8]。前人已對花椰菜的營養生理[9]、干旱和高溫脅迫[10,11]以及抗病性[12]進行了研究,但對鹽脅迫下花椰菜的生理特性研究較少。因此,研究花椰菜耐鹽機理,選擇和培育花椰菜耐鹽品種具有重要的理論和實踐意義。
種子萌發和幼苗形態建成是作物生產的關鍵時期,種子發芽質量好壞直接影響作物生長和經濟效益,外源SA對鹽脅迫下花椰菜種子萌發及幼苗生長影響的研究鮮見報道。為明確SA對花椰菜耐鹽性的生理機制,本研究以花椰菜種子和幼苗為試材,分析不同濃度外源SA處理后,種子萌發、植株生長參數及生理生化指標的變化,研究SA對鹽脅迫下花椰菜的作用機理,旨在為緩解花椰菜鹽害提供理論和技術依據,同時為解決花椰菜在栽培和育種實踐中綜合逆境因子的傷害提供新思路。
1 材料與方法
1.1 試驗材料
本試驗于2010年3-9月在甘肅農業大學農學院進行。供試花椰菜品種為先華70和祁連白雪,購自于甘肅省農業科學院。SA和NaCl購自北京化學試劑公司,含量≥99.5%,分析純試劑AR級。
1.2 試驗方法
1.2.1 SA對NaCl脅迫下花椰菜種子萌發的影響試驗共設6個處理:以蒸餾水作為對照\\(CK\\),SA處理濃度分別設置為0.5,1.0,1.5,2.0和2.5mmol/L\\(T1、T2、T3、T4、T5\\)。在預備試驗的基礎上,選取2個不同鹽敏感性的花椰菜品種籽粒飽滿種子\\(種子在蒸餾水中的初始發芽率均達100%\\),用10%\\(v/v\\)次氯酸溶液消毒15min,去離子水洗凈涼干。分別用不同處理濃度的SA溶液浸種24h,CK用等量蒸餾水浸種處理,將浸種后的種子分別在125mmol/L NaCl溶液中進行發芽試驗。采用紙上發芽床法,在洗凈、烘干的培養皿\\(直徑9cm\\)中鋪2層濾紙,將處理溶液分別加入培養皿內,至濾紙飽和,然后整齊排入50粒種子,加蓋。在25℃的恒溫培養箱內暗萌發。每個處理重復3次。稱重法補充蒸發的水分,保持溶液的濃度恒定。每日觀察并記錄發芽種子數\\(以胚根伸出種皮作為發芽標準\\),記錄7d,測定并計算種子萌發相關指標。
1.2.2 SA對NaCl脅迫下花椰菜幼苗形態生理指標的影響花椰菜種子溫湯浸種5h,25℃下保濕催芽2~3d。待種子露白播種于塑料營養缽\\(9cm×9cm\\)中,基質為蛭石∶珍珠巖=3∶1\\(v/v\\),澆灌1/2Hoagland營養液,置于人工氣候室培養,培養環境設為溫度26℃/18℃\\(晝/夜\\),光周期晝夜各12h/d,白色熒光燈作為光源,光強為\\(600±15\\)μmol/\\(m2·s\\),相對濕度75%。每處理播種20盆,每盆播2粒種子,幼苗破心時選擇長勢一致的植株定苗1株。
試驗共設6個處理:以蒸餾水作為對照\\(CK\\),SA處理濃度分別設置為0.5,1.0,1.5,2.0和2.5mmol/L\\(T1、T2、T3、T4、T5\\)。待兩片真葉完全展平后,在距根部約2cm處用注射器進行SA注根初始處理,每株20mL;2d后葉面噴施SA強化處理,每處理噴施60mL。
CK用等量蒸餾水代替。強化處理后3d,進行鹽脅迫:用注射器緩慢注入125mmol/L NaCl,每株40mL。每隔3d澆1次營養液,脅迫處理15d后測定相關形態和生理生化指標。
1.3 指標測定
1.3.1 種子萌發指標種子萌發第4天測定發芽勢,第7天測定發芽率和發芽指數。ɑ-淀粉酶活性測定參照李合生[13]的方法。發芽率\\(GP\\)=∑\\(Gt/t\\)×100%;發芽指數\\(GI\\)=∑\\(Gt/Dt\\),式中,Gt為在t日的發芽數;Dt為相應的發芽天數。發芽勢=\\(規定天數發芽的種子數/供試種子數\\)×100%。
1.3.2 形態指標脅迫處理后第20天測定幼苗株高\\(子葉節到生長點之間的距離\\)、莖粗\\(子葉節下2cm處的粗度\\)及葉面積 \\(第3片真葉展開葉面積\\)。
1.3.3 生理生化指標脅迫處理后第15天取第2片完全展開的真葉,參照李合生[13]的方法,避開葉脈打孔,測定葉綠素a,葉綠素b含量;丙二醛\\(malonic dialdehyde,MDA\\)含量的測定采用硫代巴比妥酸法;超氧化物歧化酶\\(superoxide dismutase,SOD\\)活性的測定采用氮藍四唑\\(nitrotetrazolium blue chloride,NBT\\)法;過氧化物酶\\(peroxidase,POD\\)活性的測定采用愈創木酚氧化法;游離脯氨酸含量的測定采用磺基水楊酸法,可溶性糖含量的測定采用蒽酮比色法[14]。
1.4 數據處理
所有處理每次測定重復3次,數據為3次測定的平均值。采用Microsoft Excel 2003軟件對數據進行處理;用DPS 7.05統計軟件進行方差分析,用LSD法進行差異顯著性多重比較。
2 結果與分析
2.1 SA浸種對鹽脅迫下花椰菜種子萌發的影響不同濃度SA浸種處理,鹽脅迫下2個花椰菜種子萌發相關指標隨浸種濃度的增加表現出先升后降的趨勢\\(表1\\)。與CK相比,T1、T2和T3處理可明顯提高種子發芽率、發芽勢、發芽指數和ɑ-淀粉酶相對活性。以T2處理效果最佳,先華70的發芽率、發芽勢、發芽指數和ɑ-淀粉酶相對活性分別較CK提高18.9%,23.5%,22.7%和25.1%,差異顯著\\(P<0.05\\);祁連白雪的發芽率、發芽勢、發芽指數和ɑ-淀粉酶相對活性分別較CK提高20.5%,21.3%,20.6%和28.5%,差異顯著\\(P<0.05\\)。T4和T5處理2個品種的種子發芽各項指標較CK明顯降低?！颈?】
結果表明,適宜濃度的SA浸種可以有效緩解鹽脅迫對花椰菜種子萌發的抑制作用,其中以1.0mmol/L的SA浸種效果最佳,SA濃度為0.5和1.5mmol/L時,緩解效果明顯降低,超過1.5mmol/L不具有緩解效應,高濃度SA對種子發芽有抑制作用,且濃度越高抑制效果越明顯。
2.2 SA對鹽脅迫下花椰菜幼苗形態特征的影響與CK相比,不同SA處理對鹽脅迫下花椰菜幼苗的生長發育有不同程度的影響\\(表2\\)。T1、T2和T3處理,對鹽脅迫下2個花椰菜品種幼苗的生長發育均具有較明顯的促進作用,其中T2處理的效果最佳。與CK相比,先華70的莖粗、株高、葉面積分別提高了6.1%,11.8%和6.2%,差異均達顯著水平\\(P<0.05\\);祁連白雪的莖粗、株高、葉面積分別提高了5.1%,12.2%和6.9%,差異也達顯著水平\\(P<0.05\\)。T4處理與CK差異不顯著,T5處理的花椰菜幼苗莖粗、株高和葉面積較CK降低,幼苗的生長發育受到明顯抑制,脅迫加劇?！颈?】
一定濃度的外源SA處理能不同程度地提高花椰菜幼苗葉片葉綠素a、葉綠素b和葉綠素\\(a+b\\)含量\\(表3\\),其中T1~T3處理較CK能明顯提高葉綠素a、葉綠素b和葉綠素\\(a+b\\)含量,以T2處理最佳,先華70和祁連白雪分別比CK提高23.8%,10.2%,19.9%和26.1%,13.3%,22.4%,差異達顯著水平\\(P<0.05\\);T4處理中先華70上述指標與CK差異不顯著,而祁連白雪上述指標稍高于CK;T5較T4處理的各指標均有所降低。說明0.5~1.5mmol/L的低濃度SA能有效地緩解幼苗的鹽脅迫,提高葉綠素含量,促進幼苗的生長發育,當SA濃度超過2.0mmol/L,緩解作用不明顯甚至沒有緩解作用,因此這種促進作用隨SA處理濃度的增加表現出先上升后下降的趨勢。
2.3 SA對鹽脅迫下花椰菜幼苗葉片MDA含量的影響T1、T2和T3處理葉片中MDA含量較CK明顯降低\\(圖1\\),以T2處理效果最佳,2個品種花椰菜幼苗葉片中MDA的含量降至最低,此時細胞膜穩定性最高,緩解脅迫的作用最為顯著。
T4處理MDA含量恢復至與CK差異不顯著,對鹽脅迫的緩解作用不明顯,T5處理MDA含量明顯高于CK,沒有緩解作用,甚至脅迫較CK加劇。說明SA對花椰菜幼苗鹽脅迫的緩解作用與濃度有關,0.5~1.5mmol/L的低濃度緩解作用明顯,超過1.5mmol/L的SA對鹽脅迫的緩解作用降低,甚至加劇脅迫。
2.4 SA對鹽脅迫下花椰菜幼苗葉片抗氧化酶活性的影響SA對鹽 脅 迫 下 花 椰 菜 幼 苗 葉 片 的SOD和POD活性有顯著影響\\(圖2\\)。與CK相比,T1~T3處理能明顯促進花椰菜幼苗葉片SOD和POD活性的提高,表明外源SA可以提高鹽脅迫下花椰菜幼苗的抗氧化能力,對鹽脅迫起緩解作用。其中,T2和T3處理的SOD和POD活性提高最大,與CK相比,差異均達顯著水平\\(P<0.05\\),但T2和T3兩個處理之間差異不顯著\\(P>0.05\\)。T4處理的2個品種SOD活性降至與CK相同甚至低于CK,而POD活性均較CK高。
T5處理的SOD活性較CK降低顯著,而POD活性與CK差異不顯著。SA對SOD與POD活性的影響總體上呈現“低-高-低”的趨勢,但是SOD與POD活性的降低幅度不同,表明不同濃度SA處理對SOD和POD活性的調節作用不同。
2.5 SA對鹽脅迫下花椰菜幼苗葉片脯氨酸和可溶性糖含量的影響T1~T3處理明顯促進先華70脯氨酸含量的提高\\(圖3\\),而T1~T4處理明顯促進祁連白雪脯氨酸含量的提高,且T2處理的2個品種與CK相比,脯氨酸含量增加最高,對鹽脅迫緩解作用最佳。
T4處理的脯氨酸含量與CK差異不顯著,緩解作用不明顯,T5處理的脯氨酸含量明顯低于CK,沒有緩解作用?？扇苄蕴呛康淖兓闆r與脯氨酸基本相同,表明SA能夠一定程度上提高鹽脅迫下幼苗體內可溶性糖含量,提高幼苗滲透調節能力,緩解鹽脅迫造成的滲透失水及次生傷害,綜合2個品種總體上以T3處理效果最佳,但T2和T3處理間差異不顯著\\(圖3\\)。SA處理的脯氨酸和可溶性糖含量的變化總體上呈現“低-高-低”的趨勢。
T3、T4和T5處理,可溶性糖含量的降低幅度小于脯氨酸的降低幅度。說明0.5~1.5mmol/L SA能夠在一定程度上提高花椰菜幼苗的滲透調節能力,對鹽脅迫起緩解作用\\(P<0.05\\),超過1.5mmol/L時2種滲透調節物質變化幅度的差異表明,高濃度SA作用下脯氨酸和可溶性糖對緩解花椰菜幼苗鹽害可能有不同的作用機制。
3 討論
鹽脅迫損害植物細胞的正常代謝過程,造成種子發芽率、發芽勢和發芽指數降低。SA可以提高植株的抗病性[2]、耐鹽性[3-5],促進種子萌發[4-7]等。本研究通過預備試驗,選取介于2個不同鹽敏感性的花椰菜品種種子萌發鹽脅迫臨界濃度之間的NaCl\\(125mmol/L\\)進行脅迫處理。通過不同濃度SA浸種處理,結果表明0.5~1.5mmol/L的較低濃度SA能顯著提高脅迫處理下2個花椰菜品種種子的發芽率、發芽指數和ɑ-淀粉酶相對活性,而SA浸種超過1.5mmol/L時對種子萌發起抑制作用\\(表1\\)。這同張士功等[4]在鹽脅迫下小麥種子上的研究結果基本一致。已有研究表明SA能通過提高種子的含水量[6]、POD活性和可溶性糖含量[7]來促進種子萌發。
α-淀粉酶作為種子貯存物質的氧化分解關鍵酶之一,在種子萌發過程中起了非常重要的作用。本研究結果表明SA在促進鹽脅迫下花椰菜種子萌發的同時也促進了α-淀粉酶活性的提高,說明SA是通過提高α-淀粉酶的活性而促進種子萌發的。但是SA濃度超過1.5mmol/L時對種子萌發產生一定程度的抑制現象,可能與SA干擾正常的物質代謝和能量代謝,并消耗一定的生物能有關。逆境條件下,植物細胞內自由基產生和清除的平衡遭到破壞,過量產生的自由基會對植物造成傷害,MDA是膜脂過氧化產物之一,其含量的高低表示細胞膜脂過氧化的程度和植物對逆境條件反應的強弱。本研究結果表明,1.0mmol/L的外源SA處理顯著抑制花椰菜葉片中MDA的積累,降低膜脂過氧化的程度,維持膜系統的穩定性,提高花椰菜幼苗的耐鹽能力;抗氧化酶活性與細胞活性氧水平及氧化傷害與否有直接關聯。
SOD和POD是活性氧清除酶系統的重要保護酶,在逆境脅迫中清除過量的活性氧,維持活性氧的代謝平衡,使植物在一定程度上抵御逆境傷害[15]。本研究表明,0.5~1.5mmol/L的SA處理顯著提高了鹽脅迫下花椰菜幼苗葉片SOD和POD活性,兩者協同作用,保證了活性氧的清除,MDA含量下降,緩解了鹽脅迫對幼苗的氧化損傷,幼苗對鹽脅迫的抗性增強;同時促進了鹽脅迫下花椰菜幼苗株高、莖粗、葉面積和葉綠素含量的增加,維持幼苗正常生長發育,使植物對逆境的適應能力增強,這與宋士清等[5]和佘小平等[16]對黃瓜\\(Cucumis sativus\\)的研究結果相似。
在鹽脅迫下,由于外界滲透勢較低,植物細胞會發生失水現象而造成生理性缺水,植物體內滲透調節成為一個關鍵環節。游離脯氨酸和可溶性糖作為2種主要的滲透調節物質在滲透調節中起著重要作用[5,17,18]。本研究結果表明,0.5~1.5mmol/L的SA處理顯著提高了鹽脅迫過程中2個花椰菜品種幼苗的脯氨酸和可溶性糖含量,說明花椰菜可通過滲透調節來適應逆境。脯氨酸作為一種有機滲透調節劑,雖然它積累的原因和生理意義仍然存在分歧,但是它作為一種有機滲透調節物質在植物遭受鹽害時起的作用已經被大多數人所接受。
李源等認為脯氨酸含量與耐鹽性呈負相關,脯氨酸積累可能是植物細胞結構和功能受到鹽害的一種適應性反映,可以對植物本身起到一定的防護作用。秦峰梅等和董秋麗等認為脯氨酸的積累與滲透調節和耐鹽能力呈正相關,即脯氨酸在逆境下的積累能力越強,滲透調節能力越強,耐鹽能力越強。本研究支持后者即脯氨酸含量與耐鹽性呈正相關。但SA超過1.5mmol/L時,脯氨酸和可溶性糖含量以及SOD和POD活性的降低幅度都不盡相同,也揭示了外源SA調節花椰菜體內抗氧化酶活性水平和滲透調節物質含量的復雜性。
綜上所述,外源SA可有效促進鹽脅迫下不同鹽敏感性花椰菜品種的種子萌發及幼苗的生長發育,通過提高ɑ-淀粉酶活性,提高花椰菜幼苗滲透調節能力和抗氧化能力,誘導花椰菜耐鹽性提高,減輕和緩解鹽脅迫。外源SA浸種和處理的最佳作用濃度為1.0mmol/L。
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