NAC（NAM、ATAF 和 CUC）轉錄因子是高等植物特有的一類數量較多的轉錄因子，其 N 端都包含一段約 150 個氨基酸殘基的保守序列，在植物生長發育、器官建成、脅迫應答以及品質改良過程中發揮著重要作用（邵鳳霞 等，2008），已成為當前植物基因功能及表達網絡調控研究中的熱點（Zheng et al.，2009）。第一個 NAC 基因 NAM 是 Souer 等在 1996 年從矮牽牛中克隆到的（Soueret al.，1996），隨后 1997 年 Aida 等（1997）在擬南芥中發現了 NAM、CUC2 和 ATAF1/2 等 3 種基因，CUC2 功能類似于 NAM，與植物的發育相關；ATAF1/2 的功能與植物逆境應答相關。
目前研究表明：NAC 轉錄因子在水稻基因組中有 151 個成員，煙草（Rushton et al.，2008）和大豆（Le et al.，2011）中均有 152 個，擬南芥中有 117 個（邢國芳 等，2012）。李雪林等（2010）根據水稻的 SNAC1 是抗逆性轉錄因子（Hu et al.，2006），且在非生物逆境脅迫（干旱、鹽漬）下 SNAC1的表達可以提高抗逆性，將其導入棉花后通過 NaCl 脅迫篩選出了棉花轉化體系。李鵬（2011）研究了棉花中多種 NAC 基因及其受各種脅迫時的表達，發現 GhNAC1 在棉花纖維中特異表達，其它NAC 轉錄因子在各個組織中均有表達，且 GhNAC12 明顯受低溫脅迫的誘導，GhNAC20 明顯受低溫、高鹽和 PEG 處理誘導，GhNAC16 主要對高鹽處理敏感。玉米 ZmNAC1 可以被低溫、PEG、高鹽和ABA 誘導（柳展基 等，2009）。細菌性斑點病菌侵染辣椒后 CaNAC1 被快速誘導，而在非寄主病菌侵染與抗病信號分子 SA 和 ET 處理辣椒后 CaNAC1 的誘導表達也很強烈（Oh et al.，2005）。
在中國北方地區，設施栽培中的低溫弱光是生產中最大的限制因素（閆世江 等，2010），土壤次生鹽漬化也較為嚴重（史慶華 等，2004；張海軍 等，2013）。茄子（Solanum melongena L.，2n = 2x =24）是設施栽培的主要蔬菜，目前關于茄子耐寒性（高志奎 等，2000；任國三 等，2007；王鋒，2008）、耐鹽性（吳雪霞 等，2010，2011）已有一些報道，但主要是研究其對生長發育過程中生理指標的影響，而有關茄子抗逆性基因分子育種的研究較少。作者從茄子中分離鑒定出 NAC1 轉錄因子全長，對其在逆境脅迫下時空表達模式做出初步分析，以期為茄子抗逆性分子育種奠定基礎。
1、 材料與方法
1.1 材料及其處理
選用北京農學院蔬菜育種課題組選育茄子品系 ETC01，于 2012 年 7 月中旬播種于塑料大棚，待幼苗長出 2 ~ 3 片真葉時摘取所有幼苗葉片，混合后每份 1 g，用錫紙包成若干份，液氮速凍，置于–80 ℃冰箱儲存備用。
2013 年 6 月中旬將茄子種子播種于直徑 15 cm 的營養缽內，營養基質為草炭︰蛭石 = 1︰1（體積比）。營養缽放置于北京農學院農業生物組織培養實驗室中培養，待幼苗長到 2 ~ 3 片真葉時進行不同因素處理。（1）配制濃度 50 mg · L-1GA 溶液，每個營養缽中加入 200 mL；（2）低溫 4 ℃處理，每個營養缽中加入 200 mL 蒸餾水后將整個營養缽置于 4 ℃的培養箱中；（3）配制濃度為 20 g · L-1的NaCl 溶液，每個營養缽中加入 200 mL。每個因素處理 3 個營養缽（每個營養缽 20 ~ 25 株幼苗），在 0 ~ 12 h 內定時取各處理的根、莖、葉樣品，液氮速凍，置于–80 ℃冰箱儲存備用。各處理均設加入 200 mL 蒸餾水的 1 個營養缽（20 ~ 25 株幼苗）作為處理 0 h 的對照。
1.2 SmNAC1 序列克隆
采用 UNIQ-10 柱式 Trizol 總 RNA 提取試劑盒（上海生工生物工程技術服務有限公司）提取茄子總 RNA，用 DNaseⅠ（TaKaRa）去除總 RNA 中基因組 DNA 的污染，用 RW1（博邁德）去除總RNA 中的蛋白污染，最后用 Thermo 公司的 NANODROP 2000 檢測其濃度并采用 1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測總 RNA 的完整性。以提取的總 RNA 為模板合成 cDNA，cDNA 合成體系的總體積為 20 μL，反應過程為：總 RNA 和 10 μmol · L-1Oligo（dT）18 混合液于 70 ℃水浴 10 min；然后加入 ReverseTranscriptase M-MLV 反轉錄酶（200 U · μL-1）、dNTP（10 mmol · L-1）、RNase Inhibitor（40 U · μL-1）及滅菌的雙蒸水，置于 42 ℃保溫 60 min，后于 70 ℃變性 15 min，最后存于–20 ℃冰箱作為基因擴增及實時熒光定量 PCR（Real-time quantitative PCR，RT-qPCR）的模板備用。
在 NCBI 中搜索，根據 GenBank 中已公布的辣椒 NAC（AY714222）、甘藍型油菜 NAC1（AY245879）、番茄 NAC（AY573802）、番茄 NAC1（NP_001234482.1）設計兼并引物擴增 SmNAC1的保守區。上游 S1：CAYCCDACKGAYGAAGA，下游 A1：TTCTTSTTGTADATTCGACA。
采用 Clontech 的 SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit 分別克隆 SmNAC1 的 3′端和 5′端序列，用Primer Primier 5.0設計特異引物3′S：GCTGGAAAAGCACCAAGAGGAAT和5′A：GGTTCCTGCTGCTCGGTTCGGC；UPM 通用引物 Long：5′-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′，Short：5′-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3′，由 RACE 擴增試劑盒提供。94 ℃預變性 4 min；94 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，5 個循環；94 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，5個循環；94 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，25 個循環；72 ℃延伸 10 min；4 ℃保存。
利用 UNIQ-10 柱式 DNA 膠回收試劑盒（上海生工）將擴增產物回收，凝膠電泳檢測后，用北京全式金生物技術公司 pEASY-T3 Cloning Kit 連接，轉化于 Trans1-T1 感受態細胞，藍白斑篩選，經菌液 PCR 初步鑒定后送北京三博遠志生物技術有限責任公司測序。最后根據 DNAMAN 軟件拼接序列獲得茄子 SmNAC1 全長 cDNA 序列。根據拼接出的序列利用 Primer Premier 5.0 設計特異性引物QS：AAAATAAACAGCGAAGAGAGA；QA：CTACACCAAAAAACCAAGAAA 擴增 SmNAC1 全長，同樣將擴增產物回收、連接、轉化、篩選后送測序。
1.3 實時熒光定量 PCR
采用 SYBR Green 熒光染料法，用 CFX96（Bio-Rad）實時熒光定量 PCR 儀對 SmNAC1 在不同處理下的時空表達進行檢測分析（Ficko & Cernelc，2005）。擴增目標基因 SmNAC1 的上游引物SmNAC1-S：CTTGAGGCTTGATGAATGG 和下游引物 SmNAC1-A：GTGGTAATTGTGTGGGTAAA。
茄子內參基因（宋琴，2011）Smβ-ACTIN（GenBank 登錄號：GU984779）的引物 Smβ-S：GTCGGAATGGGACAGAAGG；Smβ-A：CAGTCAGGAGAACAGGGTG。按照寶生物公司試劑盒Real Master Mix（SYBR Green）PCR 操作步驟進行，將反轉錄所得的 cDNA 分別進行梯度稀釋（1、1︰10、1︰100、1︰1 000、1︰100 000）進行熒光定量 PCR 反應，繪制相對標準曲線。標準樣 cDNA和待測樣均設 3 次重復。
RT-qPCR 擴增的反應體系為 20 μL，包括 10 μL Real Master Mix 混合液、2 μL cDNA、0.5 μLSmNAC1-F（10 μmol · L-1）、0.5 μL SmNAC1-R（10 μmol · L-1）、7 μL ddH2O。反應程序為：94 ℃預變性 2 min，94 ℃變性 20 s，53 ℃退火 25 s，72 ℃延伸 20 s，每次循環第 3 步進行熒光采集，40 次循環。內參基因的 PCR 擴增的反應體系為 20 μL：10 μL Real Master Mix 混合液、2 μL cDNA、0.5 μL Smβ-S（10 μmol · L-1）、0.5 μL Smβ-A（10 μmol · L-1）、7 μL ddH2O。其反應程序與 SmNAC1的反應程序相同。
2、 結果與分析
2.1 SmNAC1 序列的獲得
對擴增產物分別進行回收、克隆、鑒定后測序，得到長 426 bp 的中間序列，Blast 在線對比后初步證實是 NAC 基因家族，含有 NAC 家族保守結構域。根據上述保守序列設計的特異性引物，最終獲得 794 bp 長的 3′端 cDNA 片段序列（圖 1，a）、長 396 bp 的 5′端 cDNA 片段（圖 1，b）。利用引物 QS 和 QA 特異性擴增出茄子 SmNAC1 全長基因（圖 1，c），測序結果顯示 cDNA 全長序列為1 279 bp，NCBI 在線分析同源性后，命名該基因為 SmNAC1（登錄號：KF668813）。
該基因含有1個編碼302個氨基酸的完整開放閱讀框，序列如圖2，起始密碼子ATG位于124 bp，終止子 TAG 位于 1 032 bp 處。利用 DNAMAN 推測氨基酸序列與其他物種 NAC 家族序列進行多重序列比對（圖 3）：茄子 SmNAC1 含有 NAC 家族共有特點，即 N 端都包含一段保守的氨基酸序列，約 150 個氨基酸殘基，保守域包含 A、B、C、D、E 等 5 個亞結構域。
2.2 SmNAC1 蛋白的序列分析及結構預測
Protparam 在線分析顯示：茄子 SmNAC1 蛋白由 20 種基本的氨基酸組成，其分子式為C1570H2376N430O461S12，其中含量最高的氨基酸是 Lys（7.6%）、Pro（7.6%），含量最低的氨基酸是 Cys（1.3%），酸性氨基酸（Asp + Glu）總數為 38 個，堿性氨基酸（Arg + Lys）總數為 40 個，預測相對分子量約為 35.04 kD，理論等電點為 8.18，總平均親水性（GRAVY）為–0.858，不穩定指數 37.02，推測其屬于穩定蛋白。
利用 NPSA 中的 MLRC 方法預測其二級結構：SmNAC1 蛋白包含有 63 處 α–螺旋（Alpha helix），占 20.86%，41 處延伸鏈（Extendedstrand），占 13.58%；198 處無規則卷曲（Randomcoil），占 65.56%。運用 TMHMM Server v.2.0 預測此蛋白無跨膜 區 域 ， PSORT WWW Server 中 PSORTPrediction 工具預測細胞定位于細胞質中。在蛋白質結構數據庫中搜索到其同源模型，利用網站Expasy 中 Swiss Model 程序同源建模，推測蛋白的三維結構模型如圖 4。
2.3 SmNAC1 與其他物種 NAC 的同源性及系統進化樹分析
將 SmNAC1 蛋白序列通過 NCBI 中 BLAST 在線分析同源性，結果表明 SmNAC1 與番茄 NAC1（NP_001234482.1）、馬鈴薯（CAC42087.1）、番茄 NAC2（ADL60119.1）、甜椒（AAW48094.1）、煙草（ADQ08688.1）的同源性分別為 90%、90%、89%、84%和 82%。
進一步通過 DNAMAN 軟件將 SmNAC1 與 GenBank 數據庫中已經登錄的 14 種 NAC 氨基酸序列構建系統發育樹（圖 5），可見茄子 SmNAC1 與番茄、馬鈴薯、煙草親緣關系最近，與擬南芥 ATAF2在進化上有相同的起源，與矮牽牛、擬南芥 CUC2、CUC1 親緣關系較遠，推測茄子 SmNAC1 同樣具有 ATAF2 與植物逆境應答相關的功能。
2.4 SmNAC1 在不同處理下的時空表達分析
通過 RT-qPCR 對內參基因引物（Smβ-S、Smβ-A）和 SmNAC1 基因特異性引物（SmNAC1-S、SmNAC1-A）進行鑒定，熔點曲線圖顯示內參基因和 SmNAC 均只有 1 個峰，Tm值分別為 82 ℃和76 ℃，表明內參基因和 SmNAC1 所用引物都具有高度特異性，制作標準曲線顯示內參基因的 PCR擴增效率和相關系數分別為 90.8%和 0.997；SmNAC1 的擴增效率和相關系數分別為 112.5%和 0.997，表明試驗具有較高的重復性和擴增效率。最后將熒光定量 PCR 擴增產物凝膠電泳檢測均是目的片段，無引物二聚體。
用 50 mg · L-1的 GA 處理茄子幼苗，實時熒光定量 PCR 檢測根、莖、葉中 SmNAC1 的相對表達量（圖 6）可見：隨著時間的變化 SmNAC1 在根、莖、葉中均有表達，同時在短時間內表達量都上升達到最大值，處理后 0.5 h，在根和莖中的表達量與 0 h 時相比，大約分別增長 4 倍和 8 倍，隨后下降到較低水平，甚至低于 0 h 時表達量后又有所恢復；而葉片中在處理 1 h 時達到最高，與 0 h 時相比約為其 2 倍，整體表達量隨時間變化波動趨勢較小，約在 0.8 ~ 1.5 間波動。
4 ℃低溫脅迫下，SmNAC1 在根、莖、葉中都有表達（圖 7）；0.5 h 時根中的相對表達量下降到最低，莖和葉中都較 0 h 升高；整體上都隨時間的延長而升高，說明在不同器官中低溫脅迫處理對SmNAC1 的表達都有一定的誘導作用，如在根和葉片中，脅迫 9 h 時其相對表達量達到最大值，在莖中處理 6 h 時表達量水平最高。
由圖 8 可知，在 20 g · L-1的 NaCl 脅迫下，茄子根、莖、葉中 SmNAC1 都有表達，根中的表達量變化較大，莖和葉中波動較平緩。在根中處理 1 h 時 SmNAC1 的相對表達量由 0 h 的 0.95 達到峰值 4.26，可見 SmNAC1 在根中短時間迅速的誘導表達，隨后處理時間延長其相對表達量降低；在莖中處理 1 h 時相對表達量有所升高，6 h 時達到最大值 1.95，隨后降低；在葉片中 9 h 時達最大值 1.32，其整體在 0.59 ~ 1.32 范圍波動。
由上述結果可見：在茄子根、莖、葉中 SmNAC1 均能表達，說明此基因編碼的蛋白是一種在茄子根、莖、葉各器官普遍存在的轉錄因子；外源 GA 和非生物脅迫處理后表達量均發生變化，基本呈先增后降的趨勢，初步認定 SmNAC1 是一個可誘導表達的轉錄因子；而在這些不同器官中 SmNAC1表達的水平不同，根中的表達水平整體相對高于莖和葉片中，顯示在根中優勢表達，而葉片中表達水平相對穩定，可見該轉錄因子在不同器官發育過程中所起的作用有一定差異。
3、 討論
NAC 作為植物中最大一類轉錄因子，不僅參與植物生長發育過程的調控、激素調控，而且在植物抗病、抗非生物脅迫應答中也具有重要的生物調控功能。本研究中從茄子中克隆出全長 1 279 bp的 SmNAC1 基因，編碼含有 302 個氨基酸的完整開放閱讀框，含有 NAC 家族經典保守區域，包括A、B、C、D、E 亞結構域，可能負責與 DNA 及其它蛋白結合（Ernst et al.，2004），軟件預測相對分子量約為 35.04 kD，理論等電點為 8.18，推測其為穩定蛋白。綜合氨基酸序列同源性分析及系統進化樹分析，SmNAC1 與番茄、馬鈴薯、煙草親緣關系最近，與擬南芥 ATAF2 在進化上有相同的起源，可能具有 ATAF2 與植物逆境應答相關的功能。
有研究顯示，擬南芥中 NAC1 特異介導其側根發生過程中的生長素信號，表達強度與生長素濃度、側根原基的發生量呈高度正相關，并發現其編碼區上游 l kb 范圍內含有 3 個赤霉素反應元件（GAresponse complex），存在受赤霉素作用的特征（Xie et al.，2000）。煙草 NAC1 也在根尖、側根原基特異性表達，王友華（2005）驗證了該基因的表達受生長素誘導并且進一步量化了生長素和赤霉素對其的表達的誘導效應。本研究中檢測了外施 GA 后茄子不同器官的 SmNAC1 的相對表達量，同樣驗證了赤霉素能夠誘導茄子 SmNAC1 的表達，并且由于與煙草的同源性很高，同樣在根中誘導表達水平較高，但是并非只在根中特異性表達，莖和葉中均有表達，且在莖中誘導表達變化趨勢與根中相似，而在葉中表達基本維持穩定水平。有報道稱擬南芥中存在具有泛素連接酶活性的 SIAT5 蛋白，能將 NAC1 泛素化，而將 NAC1 蛋白迅速降解，研究顯示 SINAT5 過量表達后，可通過泛素化將NAC1 蛋白的快速降解（Xie et al.，2002）。這可能是造成本研究中 SmNAC1 在根和莖中表達量迅速先增后降最后基本恢復到原來水平的重要原因。
孫利軍等（2012）分析了水稻 OsNAC 家族基因在高鹽、干旱、低溫脅迫后的表達水平，發現45 個鹽脅迫響應 OsNAC 基因中 33 個上調表達，12 個下調表達，44 個低溫脅迫響應 OsNAC 基因中31 個上調表達，13 個下調表達，過量表達 SNAC1 轉基因水稻提高耐鹽性同時增強抗旱能力，結實率提高 22% ~ 34%，過量表達 OsNAC6/SNAC2、OsNAC5、ONAC045 和 OsNAC10 基因后能顯著提高水稻對干旱、高鹽的耐受力。本研究中用 4 ℃低溫及 20 g · L-1NaCl 脅迫茄子幼苗，檢測不同器官（根、莖、葉）中 SmNAC1 均有表達，雖然顯示在根中的優勢表達，但可以看出 SmNAC1 在茄子中是一種普遍存在的可誘導表達的轉錄因子，受到低溫、高鹽的非生物脅迫后顯示上調表達。
SmNAC1 可能參與了茄子對低溫和高鹽脅迫的耐受調節過程，初步預測過量表達 SmNAC1 可能提高茄子對低溫和高鹽的耐受性，為后續茄子非生物脅迫遺傳育種研究奠定了一定的理論基礎。
