辣椒屬（Capsicum）主要有 5 個栽培種（鄒學校，2009），即一年生辣椒（C. annuum）、中華辣椒（C. chinense）、漿果狀椒（C. baccatum）、灌木狀椒（C. frutescens）和茸毛椒（C. pubescens），其中一年生辣椒是分化最多、栽培最廣的 1 個種，而中華辣椒是亞馬遜地區栽培最為廣泛的 1 個種。

另外，辣椒屬還有許多近緣野生種，其中有部分已被利用，如茸毛椒。國內外科技人員在辣椒種質資源分子鑒定方面進行了全面的研究，取得了一些階段性成果。Lefebvre 等（2001）采用 AFLP 和 RAPD 標記以及結合表型數據對辣椒自交系開展遺傳多樣性研究。

陳學軍等（2007）通過 RAPD 和 ISSR 對辣椒屬的 5 個栽培種 13 份資源進行了研究，能將一年生辣椒與其他 4 個栽培種區分開來。Sanatombi 等（2010）采用 RAPD 的標記對印度曼尼普爾邦 7 個當地品種開展了種質資源鑒別工作，結果表明 7 個品種分別屬于一年生辣椒、中華辣椒和灌木狀椒。

李永平等（2011）利用 RAPD 分子標記技術對辣椒種質資源遺傳多樣性進行分析，結果將供試的 90份種質分為 5 大類群。陳學軍等（2012）采用 SRAP 和 SSR 標記對中國灌木辣椒開展了遺傳多樣性研究。孟金貴等（2012）應用 ISSR 標記開展了涮辣與辣椒屬 5 個栽培種親緣關系的研究。上述研究為辣椒遺傳育種及產業化發展奠定了基礎。

在核基因組研究中，利用核糖體 DNA 內轉錄間隔區（Internal Transcribed Spacer，rDNAITS 區）序列對藥用植物菲蘭（Lee et al.，2006）、紅山茶（田敏 等，2008）、石斛（栗丹 等，2012）、桑（陳仁芳 等，2010）、扁桃（邱蓉 等，2012）等進行鑒定和系統進化分析。ITS 區在進化過程中受到的選擇壓力非常小，且進化速率較快，另外 ITS 區序列具有保守性，不僅適合于低分類群的系統發育分析，而且可以反映種間與種內水平的變化，亦被用于種內各居群內的差異性研究（丁小余 等，2002；德英 等，2012）。近年來，ITS 作為常用分子標記已被用于辣椒屬植物的系統分類（蔣向輝 等，2010；Purkayastha et al.，2012），同時也發現了部分種類的 ITS 存在多態性。Ryzhova 等（2002）對 1 個漿果狀椒、2 個中華辣椒和 1 個一年生辣椒，蔣向輝等（2010）對 1 個湖南當地農家品種‘瀏陽朝天椒’，Purkayastha 等（2012）對 6 份辣椒素極高的辣椒材料‘Bhut Jolokia’進行了 rDNA-ITS 序列分析，由于研究材料類型與數量不足，代表面較窄，研究結論具有一定局限性。

本研究中通過多年的調查，收集了國內外不同來源的一年生辣椒和中華辣椒共 17 份，并從GenBank 下載辣椒屬的主要栽培種漿果狀椒（Bohs & Olmstead，2001）、茸毛椒、灌木狀椒（Purkayasthaet al.，2012）和野生種 C. eximium（Whitson & Manos，2005）、野生種 C. lycianthoides（Smith & Baum，2006）的 ITS 序列，結合本研究材料的 ITS 序列，分析 ITS 長度、（G + C）含量及其變異、遺傳分歧和同源性，探討辣椒資源的系統位置與進化關系。

1、 材料與方法

1.1 材料及 DNA 提取

試驗于 2012 年在廣東省蔬菜新技術重點實驗室完成。試驗材料由廣東省農業科學院蔬菜研究所辣椒育種與生物技術團隊提供（表 1），8 份材料由國外引進，其中一年生辣椒 14 份，中華辣椒 3份。采摘苗期鮮葉片，用第 7 或 8 片真葉提取基因組 DNA，提取方法參照 CTAB 法（王關林和方宏筠，2002），然后將提取的 DNA 放入–20 ℃備用。

1.2 PCR 擴增及測序

聚合酶鏈式反應（PCR）體系為 20 μL，包括 10× PCR buffer 2.5 μL，25 mmol · L-1MgCl21.2 μL，模板 DNA（40 ng · μL-1）1.0 μL，10 μmol · L-1上下游引物各 1.0 μL，Taq 酶（5 U · μL-1）0.2 μL，2.0mmol · L-1dNTP 2.0 μL，加 ddH2O 補足 20 μL。參照 White 等（1990）的方法設計 ITS 區擴增所用通用引物，ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）和 ITS5（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′）。ITS-PCR 反應程序為：95 ℃預變性 3 min，94 ℃變性 30 s，52 ℃退火 30 s，72 ℃復性40 s，共 35 個循環后，72 ℃延伸 7 min，4 ℃保存。

PCR 產物純化回收：北京鼎國 NEP013-1 DNA 片段快速純化/回收試劑盒；連接：pEASY-T1Simple Cloning Kit CT111-01 試劑盒?；厥占兓蟮漠a物連接于 pEASY-T1 Simple Cloning Vector 上，隨后加連接產物于 Trans 1-T1 感受態細胞中，37 ℃靜置培養過夜。挑取單克隆 PCR 方法鑒定陽性克隆。Invitrogen 公司測序。為確保所測序列的準確性，測序過程中使用擴增引物進行雙向測序。

1.3 數據分析

測序原始峰圖使用 Contig Express 軟件拼接，而后用 BioEdit 手工校對，用 Clustal X 對所得序列進行排列。DNAStar 軟件計算 ITS 序列的遺傳分歧及同源性百分比差異（Kimura，1980；Tamuraet al.，2011）。ITS 序列分析采用 MEGA 5.05 軟件，以茄科番茄屬（Lycopersicon）栽培種‘上海 906’作為外類群植物，采用鄰位相接法（Neighbor-Joining，NJ）構建系統樹。系統樹的每個分支的統計學顯著性分析以自展法（bootstrap）進行檢驗，重復次數為 1 000 次。

2、 結果與分析

2.1 ITS 序列長度、（G + C）含量及變異

根據 GenBank 中已報道的辣椒 ITS序列（Accession No. AY665841），確定 17 個辣椒樣品的 rDNAITS 序列中 ITS1 和 ITS2 與 3 個編碼區 18S、5.8S 和 26S 的界限。17 個辣椒樣品的 ITS 序列（只包含 ITS1，5.8S rDNA 和 ITS2）長度變化范圍在 632 ~ 651 bp（表2），14 個一年生辣椒中，編號 1 的辣椒材料 ITS 序列最短，為 632 bp，編號為 5、12 和 13 的 3 個一年生辣椒材料 ITS 序列全長為 650 bp，其余 10 個一年生辣椒材料 ITS 序列全長為 651 bp。編號為 6、7 和 8 的 3 個中華辣椒 ITS 序列全長為 644 bp，比一年生辣椒 ITS 序列全長短。（G + C）含量為 49.38% ~ 63.51%，轉換顛換比 3.37。當空位（gap）作缺失處理時，ITS 區全序列排序后的長度為 660 個位點，其中有 237 個變異位點，173 個簡約信息位點，分別占 35.91%和 26.21%。在 17 個ITS 序列中，A 占堿基總數的 25.5%，T 占 24.0%，C 占 28.8%，G 占 23.7%。

分析表明，ITS1 序列長度范圍 227 ~ 238 bp，相差 11 個堿基。編號為 5、12 和 13 的 3 個一年生辣椒 ITS1 序列長為 237 bp，其它 11 個一年生辣椒 ITS1 序列長為 238 bp。編號為 6、7 和 8 的 3個中華辣椒 ITS1 序列長為 227 bp，比一年生辣椒 ITS1 序列短。A 占堿基總數的 24.4%，T 占 20.5%，C 占 31.2%，G 占 23.8%，（G + C）含量變幅為 50.0% ~ 66.52%。當空位（gap）作缺失處理時，ITS1區全序列排序后的長度為 240 個位點，其中有 89 個變異位點，占總位點的 37.08%，70 個簡約信息位點，占總位點 29.17%。以野生種 C. eximium 的 ITS 序列為參考序列，利用 Clustalx 2.1 軟件進行比對，發現編號 6、7、8、20 和 22 在 ITS1 區有 15 個堿基缺失。

ITS2 序列長度在 234 ~ 257 bp，相差 23 個堿基，相對 ITS1 區來說變化較大。編號為 1 的一年生辣椒 ITS2 序列長為 234 bp，其它 13 個一年生辣椒 ITS2 序列長為 253 bp。編號為 6、7 和 8 的 3個中華辣椒 ITS2 序列長為 257 bp，中華辣椒 ITS2 序列長度較一年生辣椒的要長。A 占堿基總數的18.5%，T 占 23.9%，C 占 32.1%，G 占 25.5%，（G + C）含量變幅為 52.96% ~ 68.09%。當空位（gap）作缺失處理時，ITS2 區全序列排序后的長度為 257 個位點，其中有 96 個變異位點，占總位點的37.35%，65 個簡約信息位點，占總位點 25.29%。

5.8S rDNA 序列長度為 160 bp，長度高度保守。A 占堿基總數的 29.3%，T 占 26.5%，C 占 21.5%，G 占 22.7%，（G + C）含量變幅為 41.25% ~ 53.75%。5.8S rDNA 區全序列有 52 個變異位點，占總位點的 32.5%，40 個簡約信息位點，占總位點 25%。

2.2 ITS 序列遺傳分歧及同源性分析

用 DNAStar 軟件計算 17 個 ITS 序列的遺傳分歧及同源性百分比差異，結果表明，這 17 個 ITS序列的同源性（percent identity）約 25.2% ~ 100%，遺傳分歧在（divergence）約 0 ~ 3.39（表 3）。材料 13 與材料 5、7、8 的遺傳分歧較大，分別為 3.06、3.32、3.28，材料 4 與材料 7 遺傳分歧最大為 3.39。

2.3 系統進化和聚類分析

以茄科番茄屬栽培種‘上海 906’作為外類群，根據試驗獲得的 17 個 ITS 序列以及從 NCBI 獲得的 5 個不同辣椒種的 ITS 序列，用 MEGA4 進行系統進化聚類分析，結果表明，茄科番茄屬與辣椒屬的植物分化十分明顯，分別為一單支系（圖 1）。進化樹中 23 個 ITS 的平均遺傳距離為 0.238，22 個辣椒 ITS 之間的平均遺傳距離為 0.159，外類群茄科番茄屬 ITS 與 22 個辣椒屬 ITS 之間的平均遺傳距離為 1.120。在進化樹標尺約 0.11 處，22 個辣椒屬 ITS 序列可分為 6 個分支。

分支 A 共 14 個辣椒樣品全為一年生辣椒，包括 7 個國內收集的資源，還包括 6 個引自馬來西亞的辣椒資源，以及從美國收集的材料，這 14 個辣椒樣品平均遺傳距離為 0.041。分支 B 包括 3 個中華辣椒和灌木狀辣椒，該支平均遺傳距離為 0.039，表明中華辣椒與灌木狀辣椒親緣關系相對較近。分支 C、D、E、F 等分別只有 1 個辣椒樣品，分別為野生種（C. eximium）、茸毛椒、漿果狀椒、野生種（C. lycianthoides）。

由圖 1 可知，14 個一年生辣椒分別與灌木狀辣椒和中華辣椒有較近的親緣關系。分支 D 與分支A、分支 B、分支 E、分支 F 的遺傳距離平均分別為 0.077、0.055、0.086、0.089，由此表明漿果狀椒與野生種（C. eximium）和茸毛椒親緣關系相對較近。而野生種（C. lycianthoides）與茸毛椒親緣關系相對較近。

3、 討論

本研究中 17 個辣椒樣品通過 ITS 區域克隆所獲得片段長度均在 750 bp 左右，這與前人研究辣椒 ITS 序列的結果（Ryzhova et al.，2002；Purkayastha et al.，2012）相吻合。有研究表明（Bruce etal.，1995），有花植物（flowering plant）的 ITS 序列一般比其它生物要短，在 187 ~ 298 bp 之間。

本研究中的 17 個辣椒樣品的 ITS（ITS1 和 ITS2）序列變幅為 227 ~ 257 bp 之間，均在有花植物 ITS序列長度變化范圍之內，與前人研究的辣椒 ITS 序列長度（Whitson & Manos，2005；Hernández et al.，2010；蔣向輝 等，2010）基本一致。分析表明辣椒 ITS1、ITS2 變異位點分別是 89 和 96 個，占總位點的 37.08%和 37.35%，由此表明 ITS2 區變異稍大于 ITS1，這與 Purkayastha 等（2012）的觀點相一致。而分析表明，5.8S 區均為 160 bp，在長度方面高度保守。

本研究中取材 17 份，對 ITS 序列進行分析，這 17 個 ITS 序列的同源性約 25.2% ~ 100%，遺傳分歧在 0 ~ 3.39 之間，說明辣椒 ITS 序列同源性變幅相對廣泛，這可能與試材選取以及試驗方法有關，尚需進一步研究。另外，引自馬來西亞的一年生辣椒（6 個）與收集于中國內地的一年生辣椒（8 個）處于同一分支 A，未發現種內地理遷移的變化規律，這從另一角度說明一年生辣椒 ITS序列具有一定的保守性，種性比較穩定，非近期分化類群。

ITS 為中度保守序列且長度不大，在種內具有較高的保守性，同時進化速率較快；但在不同種間有不同的變異，不僅廣泛用于物種間的鑒定，而且可以用來進行種內居群間的差異性分析。辣椒ITS 序列比對結果發現中華辣椒（編號 6、7、8、20）和灌木狀辣椒（編號 22）在 ITS1 區有 15 個堿基缺失，為證實灌木狀辣椒與中華辣椒被分在一起提供了分子證據。

本研究結果表明，一年生辣椒與中華辣椒以及灌木狀椒有較近的親緣關系，這與陳學軍等（2007）采用表型數據以及 RAPD 和 ISSR 標記研究的結果一致，也與前人基于形態學和細胞學的研究結果（Pickersgill et al.，1979；Pickersgill，1991）一致。在辣椒的系統進化、聚類分析中，基于 ITS 序列（包括 ITS1、5.8S 和 ITS2）分類結果表明，不同地理種群的一年生辣椒處于同一分支 A。

但在本研究的NJ系統樹中，灌木狀辣椒與中華辣椒被分在一起，未能將它們區分開來，與Purkayastha等（2012）報道的研究結果相一致。同時也表明，借助于 ITS 序列差異還不能夠把辣椒屬不同種完全鑒別，需要借助其它的分子標記才能進行有效區分。