啟動子是調控基因表達過程中重要的轉錄調節因子，分析啟動子時空表達模式可以精確可靠地定位基因的表達部位，對研究基因的時空表達模式和驗證基因功能具有重要意義（Ayoubi & van DeVen，1996；聶麗娜 等，2008）。DUF231 家族是一類植物特有但功能未知的蛋白，這類蛋白的主要特點是包含保守的 DUF231結構域（Bouchabke-Coussa et al.，2008；Synthase，2010；Gille et al.，2011）。擬南芥中包含 46 個DUF231 家族成員，只有 3 個成員（ESK1、AXY4/AXY4L 和 TBR/TBL3）被克隆鑒定，其功能主要涉及植物抗逆反應以及植物發育階段細胞壁的次生代謝（Xin，1998；Xin et al.，2007；Lugan et al.，2009；Bischoff et al.，2010）。鑒于 DUF231 家族基因功能的重要性，研究其表達的調控機制具有重要意義。已報道的 DUF231 家族基因表達多具有組織特異性和時空表達模式，如 ESK1 基因主要在次生壁形成的細胞、木質部和維管束纖維上表達（Yuan et al.，2013）；TBR 基因啟動子驅動 GUS 報告基因在 9 d 齡擬南芥幼苗根和葉片毛狀體中高表達，在 3 ~ 4 周齡植株中卻只在葉片維管束和快速生長的根尖上表達，而 6 周后基本不表達（Bischoff et al.，2010）。目前對 DUF231 家族基因功能的了解只局限于模式植物擬南芥，在其它物種中還未見報道。

在本實驗室前期工作中首次從木本植物奧林達夏橙中克隆到 1 個受乙烯強烈誘導的 DUF231 家族基因 CsTBL1（登錄號：KJ094573），該基因與擬南芥 TBR 有 57%相似度，但是其功能和表達模式尚不清楚（張凌云，2010）。本研究中利用甜橙基因組信息，從奧林達夏橙中克隆到 CsTBL1 的啟動子，利用生物信息學手段分析了啟動子的順式作用元件，用該啟動子與 GUS 基因融合的植物表達載體轉化擬南芥，并研究該啟動子時空表達模式及對外源植物激素的響應，為初步了解 CsTBL1 在植物發育過程中的表達模式提供試驗依據。

1、 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2012—2013年在中國農業科學院柑桔研究所資源室進行。奧林達夏橙[Citrus sinensi（sL.）‘Olinda’]葉片采自中國農業科學院柑桔研究所資源圃。pEASY-T1Vector 購自北京全式金生物技術有限公司，大腸桿菌 DH5α、農桿菌 LBA4404、表達載體 pBI121 由本實驗室保存。

用于轉化的哥倫比亞（Columbia，Co1）野生型擬南芥在 22 ℃，16 h 黑暗/8 h 光照條件下營養生長 4 周，然后在 22 ℃，8 h 黑暗/16 h 光照條件下生殖生長至盛花期。

1.2 DNA 和 RNA 的提取與 cDNA 的合成

柑橘葉片和擬南芥植株的 DNA 小量提取參照天根公司 Plant Genomic DNAKit 說明書操作。使用 QIANGEN 公司 DNeasy Plant Maxi Kit 提取轉基因擬南芥基因組 DNA 用于 Southern 雜交，提取過程按操作說明書進行。使用天根公司 RNAprep pure Kit 試劑盒提取擬南芥植株總 RNA。使用TaKaRa 公司 PrimeScriptTMRT reagent Kit 反轉錄試劑盒合成 cDNA。

1.3 啟動子序列克隆、分析和載體構建

用 CsTBL1 cDNA 全長與甜橙基因組序列進行 Blastn 比對獲得 CsTBL1 上游啟動子參考序列。利用參考序列設計引物（P1/P2，表 1），以奧林達夏橙基因組DNA 為模板，經 PCR 擴增獲得的產物連接到 pEASY-T1載體上，交北京華大公司測序。測序返還序列與參考序列利用 DNAStar 軟件進行比對分析，利用 PLACE 數據庫分析該啟動子序列的調控元件（Lescot et al.，2002）。測序正確的轉化子利用 Hind Ⅲ和 BamHⅠ雙酶切替換 35S 啟動子，連接到含有 GUS 基因的 pBI121 載體上，重組質粒pCsTBL1-GUS（圖 1）。經過酶切和測序（測序用載體引物 PF/PR，表 1）檢測正確的重組質粒利用凍融法轉入農桿菌 LBA4404。

1.4 CsTBL1 基因啟動子轉化擬南芥

根據農桿菌介導的浸花法用重組質粒 pCsTBL1-GUS 轉化擬南芥（Zhang et al.，2006）。將獲得的 T1擬南芥種子消毒后播種在含有 50 mg · L-1Kan（卡那霉素）的 MS 培養基中培養，初步挑選出綠色抗性苗，并移栽到營養土中。提取 T1代抗性苗的 DNA，用 Kan 抗性位點序列設計引物 NPTⅡ（NPTⅡF/NPTⅡR，產物大小是 589 bp，表 1）檢測轉基因植株。以 NPTⅡ引物 PCR 擴增產物制作探針，對 T3代轉基因擬南芥拷貝數進行 Southern 雜交鑒定。

具體方法參照 Roche 公司生產的“DIG High Primer DNALabeling and Detection Starter KitⅠ”試劑盒說明書進行。

1.5 GUS 組織化學染色

參照 Ni 等（2008）的 GUS 組織化學染色法配置染液。取不同生長時間段的擬南芥組織放入 GUS染液中 37 ℃過夜，用 75%的酒精脫色至完全，然后在顯微鏡下觀察拍照。

1.6 外源激素處理下轉基因擬南芥 GUS 基因的表達分析

對生長20 d的T3代轉基因擬南芥用100 mol · L-1ABA，20 mol · L-1ACC，200 mol · L-1MeJA，20 mol · L-1SA 處理 12 h 后，收集樣品–80 ℃保存。使用 qRT-PCR 分析 GUS 基因的表達量。GUS（GUS-F/GUS-R）引物和擬南芥內參引物 Tubulin（Tubulin-F 和 Tubulin-R）（Oate-Sánchez et al.，2007）見表 1。定量實時 PCR 使用 Promega GoTaqqPCR Master Mix，在 Bio-Rad CFX96TM熒光定量 PCR 儀（Bio-RAD，USA）上進行。PCR 反應體系（20 L）包含 10 L Master Mix（2×）、0.2 L正向引物（10 mol · L-1）、0.2 L 反向引物（10 mol · L-1）、總 cDNA1 L。PCR 反應程序為 95 ℃變性 2 min 后按如下參數循環 40 次：95 ℃ 10 s、60 ℃ 60 s，設置溶解曲線，以檢測引物是否可用。設置 3 次生物學重復和 3 個計數重復。數據分析按照公式（2-Ct，Ct = Ct目標基因–Ct內參基因）計算。設定未處理材料的數據（對照）為 1，其他數據相對進行比較。使用 Spass19.0 軟件進行數據顯著性分析。

2、 結果與分析

2.1 序列克隆、分析和表達載體的構建

以 CsTBL1 cDNA 全長序列與甜橙基因組序列進行 Blastn比對，獲得了 CsTBL1 的基因上游啟動子參考序列，并據此設計了引物，從奧林達夏橙的基因組 DNA中克隆到該基因的啟動子。測序結果表明獲得的啟動子長為 2 361 bp（圖 2），與參考序列的相似度達到 98%。用在線網站 PLACE 數據庫分析CsTBL1 基因啟動子序列，結果見表 2，可見該啟動子含有與逆境和植物激素應答相關的順式作用元件 ABRE、ASF、GARE、GT1 和 MYB 等。

該啟動子經雙酶切從TA克隆中卸載，并且經分子操作成功替換了pB1121載體上的35S啟動子，如圖 3 所示，所獲得的 pCsTBL1-GUS 表達載體經過測序和雙酶切，證實構建正確。

2.2 轉基因擬南芥的獲得及驗證

通過 Kan 抗性篩選，共獲得 8 株抗性轉化植株。用 NPTⅡ引物檢測所獲得的 T1代轉基因植株，發現所有抗性植株均呈轉基因陽性（圖 4），說明抗性篩選有效。有 6 個 T2代轉基因株系的抗性與非抗性苗比例為 3︰1，初步認為是單拷貝插入。對轉基因株系后代 T3進行 Southern 雜交驗證（圖 5），驗證結果是 2、3、5、6、7 和 8 號株系確實為單拷貝 T-DNA 插入。

2.3 不同時期轉 CsTBL1 擬南芥植株的 GUS 組織化學染色

選取萌發 1、3、7、20 和 50 d 的 T3代單拷貝插入轉基因株系進行 GUS 染色。結果表明，種子剛剛萌發 1 和 3 d 時 GUS 表達量最高（圖 6，A、B）。萌發 7 和 20 d 的幼苗的子葉、真葉和根中GUS 活性也很強（圖 6，C、D）。在幼苗生長 50 d 后，轉基因擬南芥中 GUS 活性下降，只在葉片和莖的毛狀體以及生長的根中有表達（圖 6，E ~ H）。說明 CsTBL1 在擬南芥中的表達存在時空差異，主要在生長初期以及正在發育的組織中表達。

2.4 轉 CsTBL1 啟動子擬南芥中 GUS 基因在 ABA、ACC、MeJA 和 SA 處理下的表達用不同植物激素對生長20 d的轉基因擬南芥幼苗處理 12 h，檢測其葉片中 GUS 的轉錄水平。結果（圖 7）顯示，乙烯合成前體 ACC（1–氨基環丙烷–1–羧酸）可以強烈誘導GUS 的表達，這與之前期芯片數據顯示的CsTBL1 基因受乙烯強烈誘導的結果（張凌云，2010）相一致。外源 ABA（脫落酸），MeJA（甲基茉莉酸）和 SA（水楊酸）也均可誘導 GUS基因的表達。

3、討論

現已報道的啟動子主要分為 3 大類：組成型、誘導型和組織特異型（Carninci et al.，2006；Li et al.，2006）。組織特異型啟動子是啟動子中一種重要的類型，其結構類型比較復雜，這類啟動子控制目的基因在特定組織和器官表達，所被調控基因往往表現出與特定的代謝活動或發育時期相關的特點（宋揚 等，2007；梅麗，2008；顏彥，2013）。本研究顯示，CsTBL1 啟動子驅動 GUS 報告基因在 1 ~ 3 d 齡的整株幼苗與 7 ~ 20 d 齡幼苗的葉片和根中強烈表達，隨著植株的發育 GUS 活性降低，50 d 齡幼苗中只在葉片和莖的毛狀體以及根尖中檢測到 GUS 活性。這與其擬南芥同源基因 TBR 啟動子的表達模式相似，報告基因在幼苗的葉片和莖的毛狀體中大量表達，而成年植株中只在快速生長部位表達（Bischoff et al.，2010）。這說明 CsTBL1 表達具有時空和組織特異性，與植物早期發育密切相關。

組織特異性啟動子不僅具有一般啟動子的結構，在其上游區域還含有控制特異組織表達的調控位點（Guilfoyle，1997；梅麗，2008）。根據已報道的啟動子分析，組織特異性啟動子的順式作用元件多成保守性，如 GTGA 和 TGTGG 序列是花特異性表達元件（郭盈盈 等，2013），B-box 元件在種子特異啟動子中高度保守（Ezcurra et al.，1999）。CsTBL1 基因啟動子順式元件分析，它含有多拷貝與毛狀體特異表達相關的順式作用元件 MYB（Wang et al.，2002；Ni et al.，2008；Shangguan et al.，2008）。在柑橘的幼葉、幼梢、幼果甚至成熟果實上也有纖毛，纖毛的發育是否也有 CsTBL1 的參與尚需進一步的研究。

CsTBL1 啟動子生物信息學分析顯示其含有諸多逆境應答作用相關元件，如 ASF、ABRE、GT1MYC 和 GARE 等，推測該啟動子可能響應多個調控因子。茉莉酸/乙烯途徑和水楊酸依賴途徑是植物兩大重要的防衛應答信號途徑（Pieterse et al.，2001；Horváth et al.，2007；Loake & Grant，2007）。而本試驗中外源 ACC、MeJA 和 SA 的處理均可顯著提升 GUS 的表達量，證實了上述推論的正確性，同時也說明了 CsTBL1 可能受這兩種防衛信號途徑交叉調節。值得注意的是，前期研究及本試驗均證明 CsTBL1 受乙烯強烈誘導，是乙烯信號途徑中的下游基因，但是 CsTBL1 啟動子生物信息預測卻沒有發現乙烯相關的調控元件，此結果暗示了 CsTBL1 啟動子中存在受乙烯調控的未知元件，有待于進一步挖掘。