甘 蔗 宿 根 矮 化 病 （ratoon stunting disease,RSD）是世界甘蔗種植國家普遍發生的一種病害。甘蔗是廣西重要的經濟作物，廣西和云南甘蔗主栽品種RSD發 病 率 高，陽 性 檢 出 率 達59.64%[1].RSD是由Leifsonia xyli subsp.xyli（Lxx）引起，主要寄居在維管束木質部導管內，屬革蘭氏陽性菌[2].Davis等[2]首先實現了Lxx的體外分離培養，并命名為Clavibacter xyli subsp.xyli（Cxx）。Evtushenko等[3]根據rRNA和基因組內高G+C含量等特點，將其更名為Leifsonia xyli subsp.xy-li（Lxx）。適 合Lxx體 外 培 養 的 培 養 基 有SC、SCM、DM和S8等[4].Brumbley等[5]對SC培養基進行改良獲得MSC培養基，優化了單菌落生長條件。Monteiro-Vitorello等[6]以Lxx純培養物或感染RSD甘蔗為材料，完成了宿根矮化病原菌的基因組測序，發現果膠酶基因、纖維素酶基因和ABA合成基因可能是Lxx的致病基因；Young等[7]分析了來自澳大利亞、印度尼西亞、日本、美國等9個國家Lxx的16SRNA后，發現序列間沒有差異；陳明輝等[8-9]研究發現甘蔗感染RSD后體內赤霉素和生長素明顯降低，脫落酸明顯升高，株高、莖徑、節間長度和單莖重也明顯降低。
甘蔗的光合作用與產量有密切聯系，而RSD可導 致 甘 蔗 產 量 下 降5% ~30%,嚴 重 時 可 達60%[10],因此，研究RSD感染對甘蔗光合作用影響有重要意義。但因Lxx很難進行體外分離培養，使得研究RSD病原菌的致病機制及其與甘蔗寄主間的互作機制受到限制，關于Lxx侵染對甘蔗光合作用的影響也未見報道。本試驗以感染RSD的甘蔗品種Badila為材料，觀察Lxx在蔗莖內的定殖情況，進行體外分離培養Lxx后，接種到甘蔗品種桂糖11號（GT11）和Badila健康甘蔗種莖上，并以不接菌為對照，分析不同時期甘蔗光合作用的變化，旨在研究Lxx的侵染特性和RSD脅迫對甘蔗光合作用的影響，為進一步探討Lxx與寄主互作機制提供理論依據。
1材料與方法
1.1病原菌的分離與培養
選取疑似感病果蔗（Badila），采用PCR檢測是否感染RSD[11].確認帶病后砍取感病蔗莖基部，除掉雜質和蠟粉，自來水沖洗干凈后用去離子水沖洗2遍并噴灑酒精，在酒精燈火焰上快速消毒后去皮，切成5cm長的小段，放入滅菌的50mL離心管內，于3 500r/min室溫下離心15min.收集離心管底部蔗汁，用 定 量 中 速 濾 紙 初 步 過 濾，再 過 孔 徑0.45μm濾膜，把過濾除菌的蔗汁接種在MSC培養基上。待菌液完全被吸收后用封口膜封好，倒置于28℃恒溫培養箱中培養。培養基配方參照Brumb-ley等[5],略加修改。培養基配方（1L）：高壓滅菌組分包括Corn meal agar 17g,Bacto-agar 4g,Bacto-peptone 8g,Bovine hemin chloride（0.1%solution in0.05mol/L NaOH）30mL,MgSO40.2g,K2HPO4（0.1mol/L）13mL,KH2PO4（0.1mol/L）87mL,加去離子水至900mL,并用10mol/L NaOH調至pH7.5;過濾除菌組分包括Glucose 2g,Cysteine,freebase 0.5g,Bovine serum albumin,fraction V 2g,加去離子水至100mL,過孔徑0.22μm濾膜后加入高壓滅菌成分中并輕搖混勻。
1.2電鏡樣品的制備
掃描電鏡樣品制備：取PCR檢測帶菌蔗莖基部切成5mm×5mm小塊，放入3%戊二醛中固定2h以上，PBS緩沖液清洗3次，50%、70%、80%、90%、100%乙醇依次脫水，六甲基二硅胺烷洗3次后抽真空，粘座，IB3離子濺射儀噴鍍后用Tescan Vega 3掃描電鏡觀察并拍照。
透射電鏡超薄切片制備：將收集到的菌液8 000r/min,離心5min成菌團，棄掉PBS上清液，換用ddH2O,同樣的方法沖洗菌團2遍后，立即加入3%戊二醛固定過夜。固定后于0.1mol/L磷酸緩沖液清洗3次，每次15min,在1%鋨酸中固定1~2h,然后用乙醇-丙酮逐級脫水：50%、70%、80%、90%乙醇、1/1混合液（90%乙醇/90%丙酮）、90%丙酮、3次100%丙酮（各級每次15min）。浸透：丙酮/包埋劑=1/1滲透1h,（1/3）滲透1~3h或過夜，最后純包埋劑全浸透2h.再用純包埋劑（環氧樹脂618）包埋，并按35℃/5h、45℃/12h、60℃/24h聚合后修塊，用徠卡UC7超薄切片機切片，經醋酸鈾-檸檬酸鉛雙重染色后，用日立H-7650型電子顯微鏡觀察、拍照。
透射電鏡負染樣品制備：用0.01mol/L的PBS把已培養15~20d且長勢良好的菌落從培養基表面沖洗下來，收集于滅菌的1.5mL離心管中。取1滴Lxx菌懸液于銅網上，用1%磷鎢酸染色2~5min,晾干后置于透射電鏡上觀察。
1.3接菌試驗
選取種植在廣西大學農學院溫室大棚內的甘蔗品種桂糖11號（GT11）和果蔗（Badila）作為試驗材料。用PCR檢測生長長勢良好、無病蟲害的蔗株，確認不帶病后砍成單芽段，經50℃溫湯脫菌2h,獲得無病種莖。在單芽段兩個切面上接種108cfu/mL的菌液300μL,分接菌處理和接種0.1mol/L PBS的對照處理，28℃催芽2d.于2014年1月21日沙培育苗，待 其長至3葉期時移栽營養桶（直 徑300mm,高350mm）內土培。每處理6桶，每桶3株。土壤經過陽光暴曬3d,每桶土20kg.土壤養分，N/P/K比例為86.67/31.00/129.33.待其長至6~7葉時，PCR再次檢測，確定侵染蔗株感染上RSD.
隨機選取接菌處理中確認感染RSD的蔗株和對照處理蔗株各6株，分別在接菌后120、150、180、210d,用LI-6400XT光合儀在晴朗的上午9:00~11:00測 定+1葉 凈 光 合 速 率 （Pn）、氣 孔 導 度（Cond）、胞間CO2（Ci）和蒸騰速率（Tr），溫度和濕度均為環境 水平，人工光 源，光量子通量密度為1 500μmol/（m2·s）。
1.4數據分析
使用SPSS 15.0軟件和Excel 2007對試驗數據進行統計分析。
